私達の議定書はマウスモデルのために最大限に活用され、すべての調査者が容易に利用できる材料を利用する。この技術は、健康、疾患、または遺伝的に変化したマウスモデルに適用することができる。私たちのプロトコルは、研究者が病気や遺伝的変異の任意のマウスモデルから心臓ペリサイト生物学に関する質問に答えることを可能にします。
この手順は、心臓ペリサイト生物学に関する洞察を提供し、健康と病気の両方における心臓恒常性および体力学的研究への貢献を理解するのに役立ちます。麻酔マウスを上肢に置き、前肢をテープで留めます。胸腔を慎重に開き、25ゲージの蝶の針を使用して下降大歯をカニュール。
右のアトリウムでニックを作ります。その後、可変流動のペリタルティックポンプで1分間に2ミリリットルで、カルシウムマグネシウムフリーのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を少なくとも20ミリリットルで心臓を浸透させる。クリーンなPBSが右のアトリアから出てくると、灌流が完了します。
大大地で心臓を切り取り、氷冷カルシウムマグネシウムフリーのDPBSに入れる。その後、心臓を15〜15センチメートルのペトリ皿に移します。スプリングハサミと細かいポイント鉗子を使って、ピースを覆うのに十分な酵素溶液で心臓を小さく切ります。
次に、ピースと溶液を50ミリリットルの円錐形チューブに移し、パラフィンプラスチックフィルムで密封します。軌道シェーカーで摂氏37度で120rpmで75分間インキュベートします。酵素溶液でコラゲターゼ消化した後、100ミクロンの細胞ストレーナーを通して液体を新しい50ミリリットルチューブにデカン化し、十分な溶液を残して乾燥しないようにします。
細かい点鉗子を使用して、チューブから組織を取り出し、顕微鏡スライド上にいくつかの部分を置きます。次いで、2つの顕微鏡スライド間の組織を粉砕し、組織を分割する。新しい50ミリリットル円錐形チューブに酵素フリー培養培地でスライドをリンス。
すべての組織片が解体されるまで、このステップを繰り返します。緊張した溶液とグランドアップ組織を1本のチューブに組み合わせます。得られた懸濁液を100ミクロンの細胞ストレーナーを通して新しい50ミリリットルの円錐形チューブにひずむ。
サンプルを220倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。前の溶液を吸引し、DPBSおよびウシ血清アルブミンを含む冷たいFACS染色バッファー中の細胞ペレットを穏やかに再懸濁した。セルをカウントし、セル カウンターを使用して生存率を確認します。
DPBSおよびウシ血清アルブミンを含む冷たいFACS染色バッファーで1ミリリットル当たり100万個の細胞に細胞を希釈します。セルを染色して並べ替える準備ができました。すべてのコントロールと細胞サンプル用の5ミリリットルのFACSチューブを準備し、ラベルを付けます。
アンス染色サンプル、蛍光マイナス1コントロール、およびアイソタイプマッチコントロールに対する1本の細胞/チューブ当たりのアリコート。並べ替えに残りのセルを使用します。すべてのコントロールとサンプルを同時に調製し、染色することができます。
また、5ミリリットルのFACSチューブを準備して、合計9つの補償コントロール、2種類の未染色ビーズとマーカーパネルから7種類のフルオロクロムを準備してラベル付けします。蛍光補償コントロールを最適化するには、スクイーズバイアルから各チューブに報酬ビーズを1滴追加します。次に、ビーズに1マイクロリットルの抗体を加えます。
マーカーパネルから各抗体について繰り返します。スペクトルの重なりによる背景染色を最適化するには、FMO コントロールを使用します。FMOコントロールチューブ内の細胞に対して、マーカーパネルからすべての抗体を1~100希釈で添加しますが、抗体は1個除外します。
各抗体について、合計7つのコントロールについて繰り返します。非特異的染色にはアイソタイプ一致対照抗体を使用してください。アイソタイプマッチ標識チューブの細胞に、アイソタイプマッチ対照抗体を1~100希釈で添加します。
次に、並べ替えるセルを準備します。単離したばかりの細胞に、1~100の希釈液で抗体カクテルを加えます。また、細胞生存率染料を1対1,000希釈で添加します。
パルス渦によって補償制御を激しく混合する。室温で放置できる細胞生存性ビーズを除き、光から保護された4°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。FMO コントロール、アイソタイプに一致したコントロール、およびパルス渦によってソートされるセルを穏やかに混合します。
光から保護された摂氏4度で30分間インキュベートします。各補正制御、FMO制御、およびアイソタイプ制御に3ミリリットルのFACS染色バッファを追加します。チューブを摂氏4度で5分間300倍に遠心します。
溶液を吸引し、400マイクロリットルのFACS染色バッファーで各ペレットを再懸濁した。補正コントロール、FMO コントロール、およびアイソタイプ コントロールを使用する準備ができました。染色後、摂氏4度で5分間300回gの遠心分離によりFACS染色バッファーで細胞を洗浄します。
溶液を吸引し、FACS染色バッファー内の細胞ペレットを1ミリリットル当たり0.5百万細胞に再懸濁した。35ミクロンのフィルタートップを備えた新しいFACSチューブを使用して、染色された細胞サンプルを蓋にピペットし、重力濾液を使用して単一細胞懸濁液を得る。氷の上に置いておきなさい。
細胞を浄化するために細胞選別機を使用します。セルソーターで染色されていないセルを実行して、電圧を設定し、バックグラウンド信号を補正します。各単色補正ビードサンプルを1つずつ実行して、各チャンネルの電圧を調整し、正の信号に合わせてゲートを調整します。
データを収集します。補正行列を計算してスペクトルオーバーラップを計算するには、ソフトウェアを使用します。すべての電圧は準備ができて、設定されています。
各アイソタイプ コントロールを 1 つずつ実行します。このデータは、非特異的バインドのゲートを調整するために使用できます(存在する場合)。FMO サンプルを 1 つずつ実行します。
マルチカラーパネルによるスペクトルブリードスルーを補正するために、各チャンネルの電圧を調整します。セルソーターで染色セルサンプルを実行します。15ミリリットル円錐体のコレクションチューブに10ミリリットルの酵素を含まない培養培地で細胞を収集します。
次のゲージ戦略を使用します。まず、単一のセルのゲート。次に、生細胞のゲート。
次に、CD45陰性細胞のゲートを示します。CD34 および CD31 陰性セルのゲート。次いで、NG2陽性細胞のゲートを用いた。
そして最後に、CD146およびCD140b陽性細胞のためのゲート。ペリサイトを培養するには、得られた細胞を、コーティングした24ウェルプレート上の酵素フリー培養培地に播種する。セルインキュベーターで細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%、酸素95%に設定して培養します。
心臓全体の酵素消化および解離後、およびFACSの細胞の精製前に、細胞は、心臓から多くの異なる細胞タイプを含む粗な混合物である。FACSの精製および培養後、細胞は均質である。それらは単一の有核であり、非常に平坦であり、典型的な骨膜内の菱形形態を有する。
FACSを使用して、細胞は均質に精製される。まず、前方および側面の散乱分布に基づいて破片およびダブレットがゲートアウトされた。その後、死んだ細胞は、色素とのアミン反応のためにゲートアウトされ、生細胞よりも大きく、より強いシグナルを生み出す。
生細胞のうち、造血細胞はCD45陽性であることによってゲートアウトされた。造血細胞および内皮細胞をさらに除去するために、CD34陽性およびCD31陽性細胞をゲートアウトした。最後に、NG2陽性およびCD140b/CD146陽性細胞は、典型的なペリサイトマーカーの発現を有する血管内細胞であることについて選択された。
ヒトの脳のペリサイトと比較すると、細胞は同様の形態を有していた。マウスおよびヒト平滑筋細胞と比較して、細胞は、近球マーカーに対する免疫細胞化学による通路7で細胞の異なる形態表現型特徴付けを有し、形態またはマーカー発現に観察された変化を示さなかった。同様に、通過7での回皮細胞のフローサイトメトリーによる分析は、集団が均質なままであることを確認した。
細胞生存率は、良好な収率を得るために重要である。調達時に組織を冷たく保ち、細胞染色時に細胞を冷たく保ちます。また、酵素溶液が毎回新鮮に調製されていることを確認してください。
培養後の正しい細胞の分離を確実にするために、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色法で細胞を特徴付けます。これらの細胞は、機能的バリア研究のための内皮細胞の共培養実験、ならびにそれらの生物学的および生理学的機能および特性を研究するアッセイに使用することができる。心臓の心のペリサイトは、血管の完全性と安定性に基本的な役割を果たし、その機能不全は、世界的な心機能に結果的である。
私たちの技術により、研究者は心臓の心細胞の治療可能性を探求することができます。
