小さなRNAは多くの生物学的プロセスを調節する。したがって、それらを検出するために敏感で公平な方法を開発することが重要です。プロトコルプロトコルは、この目標に向けて前進するステップを提供します。
私たちのプロトコルは、古典的な小さなRNAライブラリの割り当て方法よりも少ないバイアスの問題に苦しんでおり、重要なことに、2つのプロングまたはメソRNAのより敏感な検出を可能にします。植物マイクロRNAなど。標準的なプロトコルに従って総RNAを抽出した後。
15%TBE尿素ゲルを200ボルトで15分間プレランします。そして、200マイクロリットルチューブに同量のホルムアミドローディング染料を使用して、5〜15マイクロリットルのボリュームで、総RNAの5〜20マイクログラムを混合します。摂氏65度で5分後、加熱された蓋をしたサーモサイクラーで、チューブを氷の上に置き、後者を直接に入れ、後者をロードし、その間に少なくとも1車線のゲルをサンプルします。
その後、ブロモフェノールがゲルの長さの約3分の2を移行するまで、ゲルを200ボルトで実行します。RNAをロードするには、まずヌクレアーゼの底を21ゲージ針で、ヌクレアーゼフリー0.5ミリリットルマイクロ遠心分離管で穿刺し、2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブをヌクレアーゼフリーラウンドボトムに入れる。次に、インキュベートし、インカリン酸ゲル染色を水に入れ、10~15分間、トランイルミニューエーターでゲルを見る前に行います。
サンプルRNAを17~29ヌクレオチドラダーバンドの間で切り取り、ゲル片を穿刺チューブに移します。最高速度でマイクロ遠心分離機でゲルを2分間回転させ、空にするはずの0.5ミリリットルチューブを取り除きます。砕いたゲルに300マイクロリットルのヌクレアーゼフリー0.3モル塩化ナトリウムを加え、室温で少なくとも2時間回転子にチューブを置きます。
インキュベーションの終わりに、粉砕したゲル片をスピンカラムに、遠心分離機をマイクロ遠心分離機で最高速度で2分間転送します。非合せの3つのプライムアダプター除去のために、抽出されたRNAサンプルと10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を十分に混合し、3つのモル酢酸ナトリウムの6マイクロリットルを混合して混合する。40マイクロリットルの磁気精製ビーズを加え、60マイクロリットルのイソプロパノールをサンプルに完全に混合します。
そして、室温で5分間懸濁液をインキュベートします。インキュベーションの最後に、溶液が明らかになるまで、サンプルを磁気ラックの上に置きます。透明な上清を取り除き、180マイクロリットルの作りたての80%エタノールをビーズに加えます。
30秒後、エタノールを取り除き、チューブを短時間回転させます。チューブの底部に回収した残留液を取り除き、ビーズを2分間乾燥させてから、サンプルを22マイクロリットルの10ミリモルトリスで再懸濁させます。2分後に溶液が透明になるまでサンプルを磁化します。
次に、20マイクロリットルの透明上清を新しいチューブに3マイクロリットルの酢酸モルナトリウム6マイクロリットルと混合し、40マイクロリットルの磁気ビーズと60マイクロリットルの100%イソプロパノールを加えます。室温で5分後、上清を取り除く前に、溶液が透明になるまでサンプルを磁化します。180マイクロリットルの新しく調製した80%エタノールを30秒間処理してから、エタノールを取り除き、サンプルの底部に溜まった残留液を除去します。
ビーズを2分間乾燥させた後、溶液が明らかになるまでサンプルを磁化する前に、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で再懸濁します。次に、9マイクロリットルの上清を新しいチューブに移し、T4 RNAリガーゼバッファーのマイクロリットルを1マイクロリットル、水の1つをサンプルに加えます。ゲル精製の場合、約1時間、ネイティブ 6%TBE ゲルで PCR 産物を 5、10、および 20 マイクロリットルずつ実行します。
完成したゲルを水中の核酸ゲル染色で10~15分間インキュベートし、150塩基対ライブラリーバンドの抽出を可能にするトランイルミエーターでゲルを見る。それらを表す150ベースペアバンドを分離することは困難であるため、これらは私たちのライブラリであり、密接に移行する副産物の存在のために、ゲルを非常に慎重に切断する必要があります。次に、ちょうど実証したようにRNAを分離します。
生シーケンスファイルの変更については、シーケンス実行中に生成された fastq シーケンスファイルをダウンロードし、必要に応じて bcl2fastq2 を使用してプレフォームデマルチプレアフィクスを行います。cutodapt を使用してアダプタシーケンスを削除し、デモンストレーションに示すようにコマンドを使用します。配列読み取り中の末端ランダムヌクレオチドを除去するために指示されたseqtkを使用する。
次に、指示されたとおりにawkコマンドを使用して、10ヌクレオチドより短い配列を廃棄する。トリミングされたシーケンスをマップするには、miRBaseを開き、成熟したfaファイルをダウンロードします。U残基をT残基に置き換えるコマンドを使用して、様々な生物から発生するデータベース内のすべてのマイクロRNAの完全なリストを生成する。
目的の生物のマイクロRNA配列を、指示に示されたコマンドで選択し、bowtie2を使用して読み取りをファイルにマッピングし、不一致を許さない。このツールを使用してシーケンス読み取りをデータベースに位置合わせし、読み取りはデータベースのマイクロRNAに完全にマップし、不一致を示すとおりにマッピングする必要があります。次に、このコマンドを使用して、整列しなかった読み取りを破棄します。
PCR増幅ライブラリの量を増加させた後、示されているように、期待サイズに対応する製品を抽出することができます。溶出後、精製されたライブラリーは毛細管ゲル電気泳動チップ上で確認することができる。期待される150塩基対産物に加えて、アダプターダイマーに対応する130塩基対種の割合を増加させ、典型的にはPCR産物の増加量がロードされるように観察される。
同様の結果は、合成小RNAの混合物からライブラリーをキット、または他の供給からの試薬を使用して調製されたときに得られる。比較のために、同じ小さなRNAミックスに対して以前に公表された結果が示される。ここで、非修飾ヒトと2つの素数O-methal改変植物マイクロRNAの検出のための標準TSプロトコルを用いたプロトコルTS5の性能の比較が示されている。
ヒト試料中の2つの素数O-メタール改変piRNAの検出も試験した。観察されたTS5としては、2つの素数のO-methal RNAの検出に対してTSよりもかなり優れたが、未改変RNAについては得られなかった。各サンプルの複製ライブラリを異なる日付で準備します。
通常、同時に作成された複製の間にほとんどばらつきがないか、異なる日付に準備されたライブラリ間で大きなばらつきが生じ得る。
