Name: methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
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この研究は、EUのホライズン2020研究・イノベーションプログラム(グラント・フィレション)の下で欧州研究評議会(ERC)から資金を受け取ったプロジェクトであるPLAMORFを通じて、F.K.へのEMBO長期フェローシップであるE.S.へのIMPRS PhD奨学金、およびMPI-MPP内部資金によって支されました。著者らは、フェデリコ・アペルトのバイオインフォマティクス分析と原稿に関するコメント、バイオインフォマティクス分析にマチュー・バハインとアミラ・クラムディに感謝したいと考えている。

1. RNAの準備
<ol><li>200mgの植物組織を液体窒素で粉末状に粉砕し、手順全体を通して組織が凍結したままであることを確認します。</li>
	<li>酸グアニジニウムチオシアネートフェノール-クロロホルム抽出プロトコルに従って所望の植物組織からRNAを抽出します。相分離中にRNAをDNAで汚染する可能性を減らすには、クロロホルムの代わりに1-ブロモ-3-クロロプロパンを使用してください。<ol>
<li>グアニジンチオシアネートと酸フェノールを含むRNA抽出試薬を1mL加え、粉砕した植物組織(100mg組織あたり500μL)を加える。反転してよく混ぜ、すべての組織が濡れているかどうかを確認します。室温で10分間インキュベートし、リボヌクレオプロテイン複合体を解約する。</li>
		<li>4°Cで12,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>1-ブロモ-3-クロロプロパン(500 μL RNA抽出試薬あたり100 μL)とボルテックスを200 μL激しく加えます。</li>
		<li>遠心分離機は4°Cで12,000 x g で15分間、上水相(約500μL)を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>イソプロパノール(500μL)1ボリューム、3M酢酸ナトリウムpH5.5(50μL)の0.1容量を加え、反転して10分を-20°Cで沈殿させることでよく混ぜます。 注: RNA沈殿を高めるために酢酸ナトリウム(NaOAc)の使用をお勧めします。このプロトコルは、数時間または一晩にわたってRNAの沈殿を延長することによって、この時点で一時停止することができます。</li>
		<li>4°Cで12,000xgで30分間遠心分離機を出し、上清を捨てます。</li>
		<li>ペレットを80%のEtOHの500 μLで2回洗浄し、遠心分離機を4°Cで12,000 x g で5分間洗浄し、廃棄します。</li>
		<li>ペレットを500 μL 99%のEtOHで1回洗浄し、遠心分離機を4°Cで12,000 x g で5分間洗浄し、廃棄します。</li>
		<li>ペレットを5~10分間乾燥させ、RNaseフリーH2Oの30μLに溶解します。 注: 代わりに、任意の RNA 抽出プロトコル (カラムベースのシステムなど) を使用します。DNase のダイジェストがプロトコルに含まれている場合は、次の手順でスキップします (ステップ 1.3)。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA濃度を測定し(分光光度計を使用して)、DNaseでRNAを20μg消化します。 注:DNAはm5Cに富んでおり、抗体はDNAとRNAを区別しません。<ol>
<li>典型的なDNase反応では、10μgのRNAを50μL反応で処理します。以下の成分を混合し、37°Cで30分間反応をインキュベートします。 10 μg の RNA x μL 10x DNaseバッファ5 μL DNase 1 μL (2単位) RNaseフリーH2O最大50 μL</li>
		<li>適切な量のDNase不活性化試薬を添加するか(DNaseキットに含まれている場合、製造元の指示に従って)、またはクリーンアップ手順(例えば、カラム精製またはフェノール/クロロホルム抽出)を行うことにより、酵素を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>毛細管電気泳動により単離されたRNAの品質と純度を確認し、RNA完全性数(RIN)が7より高い場合に進み、サンプルが良好な品質であることを確認します。</li>
	<li>オプション:リボソームRNAを除去し、rRNA除去キットを使用し、製造業者のプロトコルに従ってmRNA含有量のサンプルを濃縮します。<ol>
<li>rRNAの枯渇反応のために前のステップからDNase処理されたRNAを使用してください。RNAの総量が反応に示唆された最大量を超える場合は、複数の反応を行う。</li>
		<li>なお、rRNA枯渇後に回収されるのは、入力量の5~10%に過ぎないことに注意してください。rRNAが枯渇したRNA(全サンプルの量)を続行し、合計RNAを指すため、以下のステップで言及されている量を無視します。 注: 使用可能な rRNA 枯渇方法の比較と説明については、参照38,39,40を参照してください。rRNAは、総RNAの主要な部分であり、多くの生物で5Cメチル化されています。</li>
	</ol></li>
	<li>コントロールRNA配列として使用するインビトロ転写物(IVT)を事前に準備し、サンプルに追加します。<ol>
<li>インビトロ転写キットを使用して2つの異なるIVTを生成し、1つは非メチル化ヌクレオシドを有し、もう1つはrCTPが5-メチル-rCTPに置き換えられ、それぞれMeRIPで陰性および陽性の対照として機能する。調製された転写物は 、EGFP および レニラ ルシファーゼのものである。 注:ITは、あなたが調べている生物のトランスクリプトームに存在してはいけません。もし、IVT が同じテンプレート(例えば、両方の EGFP)からのものなら、2 つの異なるサンプルに正と負のコントロールを加えます。それらの配列が異なる場合(例えば、EGFPとレニラ)、それらは同じサンプルに加えることができます。</li>
		<li>各サンプルのスパイクは、コントロールとして、RNAの3μgあたり0.1 ng IVTあたり。</li>
	</ol></li>
	<li>RNAを約100nt断片に超音波処理します。 注:RNAせん断の条件は事前に調整する必要があり、それらは各超音波処理器によって異なります。ここで使用されるモデルの場合、超音波処理は、次の条件で行われます:ピーク電力174、デューティファクター10、サイクル/バースト200、17分。<ol>
<li>全サンプルに対して同量のRNAを超音波処理し、サンプル当たり少なくとも12 μgのRNAを80 μLの総容積(最小60 μL、最大100 μL)で、RNaseフリーH2Oで満たします。</li>
	</ol></li>
	<li>毛細管電気泳動により、超音波処理の効率とRNAサンプルの濃度を確認します。断片化したRNAの平均サイズは約100ntでなければなりません。</li>
</ol>2. メチル化RNA免疫沈降(MeRIP)
<ol><li>低結合チューブでは、9 μgの超音波処理された RNA と RNase フリー H2O を 60 μL まで加えます(濃度に応じてそれ以上)。</li>
	<li>水浴中のRNAを70°Cで10分間加熱し、氷水ミックスでさらに10分間冷却して二次構造を解約します。</li>
	<li>サンプルを3つの部分に分割します:3分の1(ステップ2.1で60 μLを取った場合は20μL)を入力サンプルとして-80°Cの別のチューブに保存します。残りの40 μLをRNaseフリーH2Oで860 μLまで充填し、次にIP用とモックコントロール用(各430μL)の2つの低結合チューブに分割します。</li>
	<li>両方のチューブに追加: 50 μL の 10x MeRIP バッファ 10 μL の RNase 阻害剤 モックサンプル中のH2Oの10 μL当たりIPサンプルのα-m5C抗体(10 μg)の10 μL 注:以前に使用した抗体クローンは、もはや市販されていません。しかし、任意の抗5-メチルシトシンモノクローナル抗体は、同様に動作する必要があります。抗体は、MeRIP11,23に使用する前に特異性についてテストする必要があります。</li>
	<li>チューブをパラフィルムで密封し、4°Cで12〜14時間インキュベートし、頭上の回転を行います。</li>
	<li>翌日、結合のためにプロテインG磁気ビーズを調製する。<ol>
<li>各チューブ(IPまたはモックコントロール)に40 μLのビーズを使用します。15 mLチューブにビーズの合計量(例えば、2つのIPと2つのモックサンプルの場合は160 μLが必要)を15 mLチューブに加え、サンプルあたり800 μLの1x MeRIPバッファー(チューブx 800 μLバッファーの#、例えば、2.2mL、および2 IP 2およびIP 2)で3回洗浄します。</li>
		<li>頭上の回転で5分間室温で洗浄を行い、磁気ラックの助けを借りてビーズを収集し、洗浄バッファーを廃棄します。3回目の洗浄後、ビーズを取り込んだビーズの初期量と同じ体積の1x MeRIPバッファ(例えば、1x MeRIPバッファの160 μLの160 μL、2つのIPおよび2つのMockサンプル)でビーズを再中断します。 注:使用されるプロテインGビーズの量は、特定の抗体タイプのビーズの結合能と使用される抗体の量によって決定されます。この場合、ビーズは約8μgのマウスIgGのビーズ1mgおよび30mg/mL濃度の結合能力を有する。したがって、40 μL は約 9.6 μg の抗体を結合するのに十分です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各IPおよびMockサンプルに40μLの再懸濁ビーズを加え、オーバーヘッド回転で4°Cでさらに2時間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを磁気ラックに1分間置き、上清を捨てるか、コントロール(非結合RNAサンプル)として保存します。</li>
	<li>0.01%Tween 20に供給される1x MeRIPバッファーの700 μLで再懸濁し、オーバーヘッド回転で室温で10分間インキュベートしてビーズを5回洗浄します。</li>
	<li>洗浄したビーズを200 μLのプロテイナーゼK消化バッファーに再懸濁し、3.5 μLのプロテナーゼ K. インキュベートを50°Cで3時間加え、800 rpmで振る。時折、インキュベーション中にビーズの堆積物が形成されている場合は、チューブの底部を手動でフリックします。</li>
	<li>800μLのRNA抽出試薬を添加し、酸グアニジニウムチオシアネートフェノール-クロロホルム抽出プロトコルを添加してRNAを抽出し、ステップ1.2のように継続する。RNAペレットの視認性を高めるために、沈殿工程でイソプロパノールに着色共沈殿剤を添加することができる。RNaseフリーH2Oの20 μL(またはステップ2.3で保持される入力ボリュームと等しい)でペレットを再懸濁します。</li>
</ol>3. ダウンストリーム解析
<ol><li>50 の底読み取り長さ (SE50) を持つシングル エンドシーケンスの入力および IP サンプルを送信します。</li>
	<li>カットアダプト41 を使用してトリム3'エンドアダプタと48 nt未満の読み取りを破棄します。</li>
	<li>ミスマッチの場合は6%、最大イントロンサイズは10 kbのSTAR42 を使用して、トリミングされた読み取りをシロイヌナズナシスゲノム(TAIR10アノテーション)にマッピングします。さらに分析するために、一意にマップされた読み取りを保持します。</li>
	<li>2つの異なる方法を使用して入力と比較してIPサンプル中の濃縮されたRNA断片を同定し、両方によって有意に濃縮されたものを考慮する。<ol>
<li>まず、プールされた IP と入力の MACS2 ピーク呼び出し元43 を使用して MeRIP-seq ピークを検出します。</li>
		<li>第二に、マイヤーら22 およびヤンら17に記載されているMeRIP-seqピークコールの分析に従ってください。<ol>
<li>カスタム R スクリプトを使用して、ゲノムを別の 25 nt ウィンドウに分割し、最後にマップされたヌクレオチドの位置に基づいて各ウィンドウの一意にマッピングされた読み取りの数をカウントします (読み取りは 100 nt RNA フラグメントから発生するため)。</li>
			<li>フィッシャー正確検定で入力と比較して、IPサンプルで大幅に富んだウィンドウを計算します。</li>
			<li>少なくとも 2 つの連続したウィンドウにまたがる大幅に豊かなピークを維持し、1 つのウィンドウだけをカバーするピークを破棄します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>両方の方法で見つかった有意に富んだピークを持つゲノムのアポイントトされた領域(トランスクリプト)を特定する。</li>
	<li>または補完的に、特定のRNA標的のIPサンプル内の濃縮をテストします。<ol>
<li>ランダムな六角形でRNA(入力、IP、モックサンプルの同じボリューム)を逆に書き起こします。</li>
		<li>ΔΔCt法を用いて入力、IP、モックを比較して、選択したターゲットに対して定量的リアルタイムPCRを実行します。 注: 生成された製品は、平均フラグメンテーションサイズであるため、100 bp 以下でなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

RNAはエピトランスクリプトーム44を形成する100以上の異なる塩基修飾4を運ぶ。これらの変更は、翻訳と信号の規制の追加の層を追加します(5、6,8,20,45,46でレビュー).初期の研究では、RNA28,47上の転写後修飾の存在を検出することができたが、エピトランスクリプトロミクスの役割を理解するために特異的な改変RNAを同定する必要がある。MeRIPは、転写物全体の21,22をRNAメチル化部位をマッピングする方法として設計された。特定の抗体が利用可能な場合は、任意の修飾に適合させることができます。
このプロトコルの主な強みは、RNAとユーザーにとって比較的単純で安全であること(例えば、5-azaCは植物およびヒトにとって非常に有毒である)、配列または酵素情報を修飾する必要がなさることです。さらに、IPによるメチル化RNAの濃縮は、濃縮工程を含まない亜硫酸塩シーケンシングとは異なり、検出される低い豊富なmRNAの可能性を高める。MeRIPの2つの連続ラウンドが行われると、メチル化部位を含むRNA断片の濃縮がさらに22に増加する。MeRIPの限界の1つは、特にmRNAメチル化試験に適用される場合、アッセイの入力として必要な大量のRNAです。リボ枯渇(またはポリ(A)濃縮- ステップは、重く修飾リボソームRNAによって引き起こされる背景を減少させますが、それは総RNAの90%以上を除去します。DNAは、5メチル化されたシトシンが豊富であるため、完全に除去する必要があります。もう一つの欠点は、メチル化の正確な位置の低い解像度です。抗体によるインキュベーション前のRNAの超音波処理は、100〜200ヌクレオチドへの修飾を含む領域を絞り込むことによって、この方向に向かって役立ちます。MeRIPを深いシーケンシングと組み合わせると、シーケンス読み取りが潜在的なメチル化部位の周りにガウス分布を形成するにつれて、m5Cサイト予測の解像度が高くなります。さらに、抗体の特異性は、アッセイの前に確認する必要があり(例えば、RNAドットブロットアッセイで、修飾されたヌクレオチドで合成されたオリゴで行われる)が、しかし、抗体が実際に密接に関連する修飾(例えば、m6Aおよびm6Am)を区別できる範囲は、フィールド48、49の議論のポイントである。さらに、高度に構造化されたRNAは、抗体-抗原相互作用を妨げる可能性があり、IP以前のRNAの断片化と変性に主に対処される別の制限である。それどころか、二次構造によっても影響を受ける亜硫酸塩シーケンシングは、断片化ステップを含まないし、これは、バイサルファイトシーケンシング16、16によって予測されるm5C部位とmRNAとの間に不一致を引き起こす理由の1つかもしれない。他のシトシン修飾(例えば、hm5C)も、亜硫酸水素塩媒介脱アミノ化35に対して耐性である。
MeRIP-seqの改変には、光活性化可能なリボヌクレオシド(光架橋支援m6A-seq、PA-m6A-seq 50)の導入により架橋ステップが含まれるか、またはUV光を使用してIP後に抗体RNA架橋を作成する(miCLIP49、個々のヌクレオチドリューション分解能とは異なる方法)将来的には、RNAメチル化に関する知識が蓄積するにつれて、修飾酵素および/またはメチル化が出現するコンセンサス配列に基づいて、よりターゲットを絞ったアプローチが望ましいかもしれません。リーダータンパク質の同定は、転写後修飾の分子およびシグナル伝達機能の理解に不可欠です。ナノポアシーケンシング技術は、RNA17の事前処理を行うことなく改変ヌクレオチドを直接同定することが可能であるが、配列深度およびバイオインフォマティクス解析に関する改善の余地はまだある。全体として、MeRIP-seqは現在、メチル化RNA転写物を同定するための確立された、信頼性の高い、公平なアプローチです。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

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Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

生命の3つの王国すべてにおいて、RNA種は転写後修飾を受け、これらの機能的に関連する生化学的修飾に関する研究を「エピトランスクリプノミクス」と呼ぶ。エピトランスクリプトミクスは成長分野であり、RNA分子の修飾を研究し、マッピングするために様々な方法が開発されている(1,2でレビュー)。100以上のRNA修飾が発見され、rRNA、tRNA、その他のncRNA、ならびにmRNA3、4で検出された。tRNAおよびrRNAにおける化学的に多様な転写後修飾の存在および機能は5、6、7、8に広く研究されているが、最近になってmRNA修飾が特徴付けられている。植物において、キャップ構造9、m1A10、hm5 C11、12、および排尿13においてm7Gを含む多くのmRNA修飾がこれまでに同定されている。しかし、唯一のm6A A10、14、15、m5C11、16、17、およびシロイヌナでは写写し全体にマッピングされている。転写後mRNA塩基修飾は、いくつかの発達過程に関与する19,20.
エピトランスクリプソミクスで最も一般的に使用されるアプローチの1つは、メチル化されたRNA免疫沈降と深いシーケンシング(MeRIP-seq)です。MeRIP-seqは、哺乳類細胞21,22においてm6Aを研究するために2012年に開発された。所望の修飾のために抗体を使用する必要があり、修飾されたヌクレオチドを運ぶRNA断片を濃縮することを目的とする。通常、深いシーケンシングを行い、濃縮フラグメントまたは定量PCRを同定してマッピングし、特定のRNA標的を検証します。MeRIPの精度は、同様の修飾に対して修飾されたヌクレオチドを認識する抗体の特異性に基づいている(例えば、m5Cおよびhm5C11、23)。m6Aに加えて、MeRIP-seqは、いくつかの生物11、17、23、24、25のm1Aおよびm5C RNAメチル化を研究するためにも適用されている。
第5炭素位(m5C)におけるシトシンのメチル化は、最も一般的なDNA修飾26,27であり、最も一般的なRNA修飾の1つも3,4である。m5Cは1975年28年に真核生物mRNAで検出されたが、最近になってようやく、修飾転写をマッピングすることに焦点を当てた研究を行い、コーディング中および非コーディングRNA11、16、17、23、29、30、31、32、33、34をコーディングした。
m5 CRNA研究で使用される代替方法としては、非メチル化シトシンからウラシルへの化学変換(バイサルファイトシーケンシング)および既知のRNAシトシンメチルトランスファー酵素のRNA標的への不可逆的結合(miCLIP、アザ-IP)に基づく免疫沈降アッセイが含まれます。簡単に言えば、バイサルファイトシーケンシングは、5メチル化シトシンの特徴を利用して、未改変シトシンをウラシルに脱アミノ化する亜硫酸ナトリウム処理に耐性を持つ。この方法は、最初にDNA用に開発されたが、RNAにも適応しており、多くの研究は、RNA16、23、29、32、34、35のm5C部位を検出するためにこのアプローチを選択した。miCLIPとaza-IPの両方が、RNAシトシンメチルトランスフェリン酵素の以前の知識とそれぞれの抗体の使用を必要とします。miCLIP(メチル化個別-ヌクレオチド分解能架橋および免疫沈降)の場合、メチルトランスセリン酵素は、RNA基質に結合するが、放出できない30になるように単一のアミノ酸変異を運ぶ。アザ-IP(5-アザシチジン媒介RNA免疫沈降)において、外因的に提供された5-azaCがRNAポリメラーゼによって標的RNA分子31に組み込まれるとき、5-azaCヌクレオシドとRNAシトシンメチルトランスシロール酵素との間に不可逆的結合が形成される。
これらの3つの方法の主な利点は、m5Cの単一塩基分解能マッピングを可能にする点である。さらに、miCLIPおよびaza-IPは、選択したRNAシトシンメチルトランスレシナーゼの特異的標的に関する情報を提供し、転写後RNA修飾のメカニズムおよび役割を深く解読する。しかし、MeRIP-seqアプローチは、以前の知識が必要なくトランスクリプトーム全体のm5C領域を同定することができ、亜硫酸水素塩処理や5azaCによるインキュベーションなどの過酷な化学的および温度条件を回避します。MeRIPおよびバイサルファイトシーケンシングは、二次RNA構造36によって阻害され得る。免疫沈降前のMeRIPアッセイに含まれる断片化ステップは、抗体結合を容易にし、m5C同定の分解能を高めることを目的としています。
言及する価値のあるもう一つの方法は、RNAヌクレオシドの質量分析(MS)である。MSはDNAとRNAの両方であらゆるタイプの修飾を検出し、区別することができます。簡単に言えば、RNAを抽出してDNaseを消化し、脱塩して単一のヌクレオシドに消化する。RNAヌクレオシドは、質量分析計によって分析される。この方法は、各修飾のレベルを定量化するために使用することができ、それは抗体または化学変換に依存しません。しかし、大きな欠点は、RNA修飾の存在に関するバルク情報を提供することです。改変をマッピングするためには、ヒトtRNALeu(CAA)37の場合のように、MSは、特定のRNA分子に関するRNase消化およびシーケンシング情報と組み合わせる必要がある。
ここでは、シロイヌナズナシス17におけるm5C RNAメチル化を研究するために用いられるMeRIPアッセイについて説明し、議論する。

<table><tbody><tr><td>anti-m&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;C antibody</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (discontinued), A3002 available</td><td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td></tr><tr><td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNA-free kit</td></tr><tr><td>Co-precipitant of nucleic acids</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glycoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; transcription kit</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td></tr><tr><td>Low-binding reaction tubes</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protein G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td></tr><tr><td>Sonication tubes</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>RNA extraction reagent</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary electrophoresis machine</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>discontinued</td><td>5417R model</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Focused-ultrasonicator</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Incubation bath</td></tr></tbody></table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

m5 CなどのRNA上の二次塩基修飾は、修飾されたRNA分子の構造および機能に影響を与える。メチル化RNA免疫沈降およびシーケンシング(MeRIP-seq)は、メチル化RNAを濃縮し、最終的に改変されたトランスクリプトを同定することを目的とした方法です。簡単に言えば、超音波処理されたRNAは、5メチル化シトシンの抗体でインキュベートされ、タンパク質Gビーズの助けを借りて沈殿する。濃縮フラグメントは、次にシーケンスされ、潜在的なメチル化部位は、読み取りとピーク検出の分布に基づいてマッピングされます。MeRIPは、任意の事前配列または酵素の知識を修飾する必要はありませんので、任意の生物に適用することができます。さらに、断片化の他に、RNAは他の化学的または温度処理を受けないようにします。しかし、MeRIP-seqは、メチル化領域を少数のヌクレオチドに絞り込むことができるが、他の方法のようにメチル化部位の単一ヌクレオチド予測を提供しない。異なる修飾特異的抗体を使用することで、RNAに存在するさまざまな塩基修飾に対してMeRIPを調整することができ、この方法の可能な用途を拡大することができます。

この方法の概略を図 1に示します。プロトコルの最初の重要なステップは、良好な品質のRNA(RIN≥7)を取得し、約100 ntフラグメントにそれを超音波処理することです。両方のステップの効率は、チップベースのキャピラリー電気泳動機によって調べられる。 図2Aでは、良好なRNAサンプルの代表的なランが示されている。サンプルは、使用するキットの検出範囲(5-500 ng/μL)の範囲内にある濃度を有するために、チップにロードする前に1:10希釈されます。同じサンプルも超音波処理後に実行され、図 2Bに示されています。1つの均一なピークが図の左側にシフトし、約100ヌクレオチドの大きさであることに注意してください。低濃度は、断片化中のRNAの損失によって引き起こされるだけでなく、サンプルの体積が増加したため(60-100 μL、ステップ1.7.1)の両方が原因です。
IPおよびモックサンプルの品質はqRT-PCRによって評価することができる。この目的のために、スパイクインIVTは正と負のコントロールとして機能します:メチル化IVTは、すべてのシトシン位置にm5Cがあり、IPサンプルで高度に濃縮されると予想されます。逆に、非メチル化IVTはIPとモックの間に違いを持つべきではありません。2つのコントロールIVT(EGFP および レニラ ルシメラーゼ)のqRT-PCRアッセイで使用されるプライマーを 表1に示します。実際、 図3に示すように、メチル化IVTの約80%がIPサンプルで回収され、モックでは約2%しか回収されなかった。非メチル化制御では、IPサンプルとMockサンプルの両方で回収率が1%を下回った。これにより、メチル化RNAフラグメントが沈殿し濃縮されたMeRIPの効率が検証され、サンプルを下流分析に使用できることを示す優れた指標となります。さらに、非メチル化IVTのフォールド濃縮(IP対モック比)を閾値として適用して、qRT-PCRアッセイにおける濃縮の有意性を推定することができる。
読み取りをゲノムに合わせた後 (図 4)、ステップ 3.4.1 および 3.4.2 で説明されているピーク呼び出しアルゴリズムが適用され、入力と比較して IP サンプル内で富化された統計的に有意なウィンドウを識別します。これらの窓に対応する配列はさらに、保存されたメチル化関連モチーフ11、17を検索するためにさらに使用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> 図1:MeRIP-seqプロトコルの概略表現 RNAサンプルは5メチル化シトシンの抗体でインキュベートされ、複合体は結合RNAと一緒に抗体を捕捉するプロテインG磁気ビーズで引き抜かれる。溶出したRNAサンプルは、深いシーケンシングおよびqRT-PCRによって分析されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> 図2:RNAサンプルの品質分析から代表的な結果を得た。 (A) 修飾された全RNA植物サンプルの代表的なプロファイル。(B)100ntフラグメントへの超音波処理後のRNAサンプルの代表的なプロファイル。毛管電気泳動ソフトウェアからの出力ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> 図3:コントロールIVTのqRT-PCR分析 メチル化および非メチル化インビトロ転写物は、それぞれMeRIPアッセイの陽性および陰性対照として使用された。免疫沈降後、メチル化されたIVTはIPサンプル(緑色)では高く濃縮されますが、Mockサンプル(抗m5C抗体なし;紫色)には含まれません。非メチル化IVTは、IPとモックの間に濃縮と違いを示さなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> 図 4: 代表的なトランスクリプトの前後の MeRIP の配置を読み取る。 入力サンプル (上の行) と 2 つの IP 反復 (中央と下の行) 内の特定のトランスクリプトに位置合わせされた読み取り。ブラックボックスは、MACS243 とMeRIP-seq22 ピークコール分析に基づいて、識別された濃縮された50 nt長いウィンドウを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td colspan="2">プライマーペア</td>
			<td colspan="2">製品順序</td>
			<td>製品長</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">エグFP</td>
			<td colspan="2">のために:5'- GGCAACTACAAGACCCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">グッカアカカアガACCCGCGッカガグ グガードトCGAGGGCGACACCCTG グガアッチャクチャクガグガグッガグ</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">レヴ: 5'- GCCCTTCAGCCgATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">レニラルシメラーゼ</td>
			<td colspan="2">対象: 5'- ガガアタクトクトグガーアック -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ガガタータアクテクトグガアアク アクトットカッカサーアアトカガガア アクトガアカガアガトテッカGCGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">レヴ: 5'- GCTGCAATTCTTGGTCTCTCtAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:qRT-PCR分析用のプライマーおよび生成産物に関する情報。
バッファレシピ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

メチル化されたRNA免疫沈降アッセイは、メチル化RNAフラグメントを濃縮するために使用される抗体ベースの方法です。深いシーケンシングと結合して、それはm5C修飾を運ぶ転写物の同定をもたらす。

シロイヌナズナのm5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.5K ビュー.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. メチル化されたRNA免疫沈降アッセイは、メチル化RNAフラグメントを濃縮するために使用される抗体ベースの方法です。深いシーケンシングと結合して、それはm5C修飾を運ぶ転写物の同定をもたらす。

ビデオ: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

RNAの測定方法<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup細胞や組織における&gt; -methyladenosine変更

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

生化学

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

遺伝学

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

発生生物学

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

化学

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

生物学

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

ウイルス感染時のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプトームの探索:HIVの例

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

シロイヌナズナの^m5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

要約

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RNAの測定方法

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

TRNA イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン

ウイルス感染時の^m6Aおよび^m5Cエピトランスクリプトームの探索:HIVの例

シロイヌナズナのm5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

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RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

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質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン

ウイルス感染時のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプトームの探索:HIVの例

シロイヌナズナの^m5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

TRNA イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

ウイルス感染時の^m6Aおよび^m5Cエピトランスクリプトームの探索:HIVの例