医学 (定刻センター) の技術革新のオーストリア研究推進機構 (ミサイルフリ ゲート艦; プロジェクト番号 850681)、大学の応用科学上オーストリア基本資金調達イニシアチブ (プロジェクト GlucoSTAR)、センターによって資金が供給されたこの作品オーバーエスターライヒ州の基本的な資金を受け取る。

EU によると、ディレクティブ 2010/63/、胚の最初 3 分の 2 の中に孵化した非鳥類胚の実験は倫理委員会の許可を必要はありません。
1. ストレージと卵の繁殖
<ol><li>地元のブリーダーから受精鶏卵 (資材表) を取得します。 注: 卵は、実験のため使用前に敷設した後は、10 日間、加湿雰囲気の 14 ° C で保存されるかもしれない。</li>
	<li>10 の 40-60% の平均湿気の 38 ° C で卵を孵化させなさいまたは 11 日インキュベーター、常に卵になります。</li>
</ol>2. 卵の選択
<ol><li>11 日間の培養後の受精卵を確認します。このステップでは、candling ライトを使用します。Candling ランプのフリンジを浸し、印肉と卵のとがった側をキャンドルします。</li>
	<li>空気の膀胱を識別するために卵の上に明るさの違いを確認します。 注: とき卵がー、卵白に暗いですが、空気の膀胱が円形より透明性の領域として表示されます。</li>
	<li>空気の膀胱の検出後に場所をマークするために、以前に適用したインクで卵に対して若干ランプを押すと。</li>
	<li>卵白と空気の膀胱の明るさの違いが表示されないこの段階で非受精の卵を除外します。</li>
</ol>3. 物質の注入
<ol><li>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) バッファーに必要な濃度の物質を希釈することによって (例えばハーブエキスやインスリン) 関心のある物質を準備します。たとえば、3.3 U/mL の市販インスリン アナログ HBSS の。</li>
	<li>選択した化合物のアプリケーションは、慎重に空気の膀胱のマークされた領域にピンセットの先の尖ったペアで卵殻をつつきます。注射器の針の直径より大きい穴を形成しません。注射器を介してついばんだの領域に関心のある物質を含む緩衝液 (300 μ L) を挿入します。 注: は、生殖不能、1 ml の使い捨て注射器、ピペット チップおよび容器を使用します。実験のための実験用の上着を着用します。</li>
	<li>物質の血ブドウ糖を減らす効果を判断するには、それぞれ 60、120、180 分の定温器に戻って卵を置きます。基底の血ブドウ糖のレベルを決定するため、少なくとも 10-15 非治療卵が含まれます。</li>
</ol>4. 毒性試験
<ol><li>24 時間選択した化合物のアプリケーション後、少なくとも 30 のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファー (全体卵殻膜をカバーするために十分な) と卵殻膜を平衡 s。</li>
	<li>離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。</li>
	<li>先の尖ったピンセットのペアで慎重に卵殻膜をやってのけます。</li>
	<li>病変の血管を確認し、ニワトリ胚の活力 (例えば運動) を確認します。 注: は、有毒なハーブ抽出の適用後重要な非重要な胚との比較のため図 1を参照してください。</li>
</ol>5、血糖値の測定
<ol><li>それぞれの時点で慎重に空気膀胱上卵殻を削除し、(全体卵殻膜をカバーするために十分な) PBS バッファーと卵殻膜を平衡します。</li>
	<li>離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。</li>
	<li>慎重に先の尖ったピンセットのペアで卵殻膜をやってのけます。</li>
	<li>カットし、漿膜マイクロ シザー、適切な血管へのアクセスを有効にするを削除します。膜を切り取り、少なくとも 2 ~ 3 cm。膜胚の不要な血液損失を避けるために自分自身のすべての大型船をカットしないでください。</li>
	<li>胚の腹部から大きな容器を探します。閉じたマイクロ ハサミで卵白からこの船を持ち上げ、プラスチック製の pH ストリップの上に置きます。マイクロはさみで開催されている容器の下で pH ストリップを移動し、引いてマイクロはさみ離れて慎重に。</li>
	<li>次の手順で血液の希釈を避けるためにピペットで漿膜の下に液体の 1-2 の mL を削除します。容器をカットする前に、容器、フィルター紙の pH ストリップを乾燥します。</li>
	<li>1 つの側面のマイクロはさみで慎重に血管をカットします。切らない血管を通じて完全に。 注: 船は約 1 mm 厚です。それはオフ ・ ストリップが空転し、採血が可能ではない、完全に船を通って切断を避けるために容器の半分以上をカットしないでください。</li>
	<li>ピペットを使用して pH ストリップに漏れの血を収集します。10 マイクロリットル血液の血糖測定器を使用してグルコース レベルを決定する必要があります。</li>
</ol>6. 統計学的評価
<ol><li>時点あたり少なくとも 10 個々 の卵の平均値を計算し、コントロール卵 (非またはバッファー処理卵) のいずれかにこれらの値を正規化します。</li>
	<li>その後、減少の割合を決定します。さらに、肯定的な制御としてインスリンを使用します。 注: は、少なくとも 3 回各実験を繰り返します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ヘット カム アッセイは、業界12での動物実験に広く使用されている代替試験システムです。ここで説明したovo でシステムは、ヘット カム アッセイの変更されたバージョンを表しています。元の形式で、化合物と定式化の刺激特性や血管新生14,15,16の解析を研究するヘット カム実験を行い、テスト方法を適応しています。推定されるインシュリン擬態特性12化合物。これらの実験は、動物実験とは見なされませんので、萌芽期の開発の最初 3 分の 2 の中に孵化した非鳥類胚実験ディレクティブ 2010/63/EU によると倫理委員会の許可は必要ではありません。最近の研究は、GLUT4 ベース転座プライマリ画面10での血糖値を減らすために識別されている選択したハーブ抽出物の効果を特徴付けるovo でシステムの適合性を証明している、インスリン12,13の不在。Ovo でシステムの良好なパフォーマンスのための重要なポイントがあります: 最初に、受精卵を提供する信頼できるブリーダーです。ローマン クラシック ブラウン チキンは、品種の良い選択です。第二に、毒性の実装は除外されるべき調査の複合ニーズの毒性をテストします。さらに、適切な血管の血のコレクションのための準備は重要です。血液の非推奨の損失につながるよう自体、漿尿膜内大血管の切断を避けるために重要です。さらに、船は、pH のストリップにカットは、前にそれは、なでられる乾燥ろ紙を使用して収集した血液の希釈を防止します。最後に、実験のための十分な数が重要であると表示されます。各時点の 3 倍それぞれ実験繰り返しの少なくとも 10 の卵を使用してお勧めします。
当然のことながら、この卵のアプローチのいくつかの制限があります。物質卵殻膜から吸収され、漿膜と密接な接触に入って来るまでに最大 30 分かかる、応用化合物に胚の急速な応答を定量化することはないです。さらに、いくつかの化合物は頻繁に漿尿膜の血管の病変の結果適用濃度の有毒な可能性があります。したがって、細胞毒性テスト約 24 時間のための化合物の長期培養に基づく合理的なが表示されます。最後に、化合物の応用に使用されるバッファー システム アッセイのパフォーマンスに大きな影響があるとわかった。12現在、HBSS バッファーは使用胚の血糖値に最小の効果を得られるので。
将来のアプリケーション HBSS の代替として追加のバッファー システムをテストすることがあります。さらに、コレステロール、トリグリセリド、リポタンパク質など追加の血液パラメーターにハーブ抽出物の影響は、魅力的な質問かもしれません。
Ovoの新しい体制は、動物実験を必要とせず生きている有機体でインスリン模倣の特性を持つ物質をテストする有望かつ重要なツールです。したがって、体外と体内のアプローチの間のギャップを埋めます。既存の ovo モデル システム17と比較すると我々 は 10 または孵卵 11 日に胚を使用するよう、ストレプトゾトシン (STZ) 治療で糖尿病を誘発する必要はありません。この段階でインスリン産生が開始していないが、胚は、既にインシュリン敏感です。14-17 日齢の胚が使用される17場合また、倫理委員会の許可が必要になる可能性があります。さらに、代替戦略18と比較して、化合物の応用ここで説明がより少なく有害な骨の折れる、実験のスループット レートを増加します。
まとめると、この卵のアプローチは、インスリン模倣物質の血液減少効果は生きている有機体でテストする必要がある場合は魅力的なシステムです。

糖尿病は、高血糖によって特徴付けられる代謝性疾患、インスリン分泌やインスリン アクション1の欠陥によって引き起こされます。すべての糖尿病の症例の 90% がカテゴリー 2 型糖尿病 (2 型糖尿病)、個人がほとんどインスリン欠乏2およびインスリン抵抗性を示します。いくつかの要因は、大麻の過剰摂取、加齢と運動不足に関連する特にそれらのライフ スタイルの変化など、2 型糖尿病の世界的な発生率を高めるために知られています。約 4 億人は、国際糖尿病連合 (IDF) によると世界的な糖尿病があります。この番号は、6 億3の 20 年以内に到達する予定です。
高血糖やインスリン抵抗性、高血圧、高脂血症、耐糖能異常、冠状心臓病、脳血管障害などによる糖尿病合併症は大幅に減少平均余命および品質4に します。影響を受けた個人が必要な血糖値を下げる薬物療法;しかし、メトホルミン5などの薬の使用は、しばしば劇的な副作用6,7,8関連付け。そのため、さらに安全な広く利用可能な安価な糖尿病治療のアプローチが必要です。
さまざまなハーブ化合物、エキス、植物および栄養補助食品は、様々 な細胞機能を調節することによって機能のインシュリン擬態プロパティに帰されています。重要な機能は、ブドウ糖の運送者 (GLUT4) 4 の転流の刺激細胞膜細胞内貯蔵コンパートメント、筋肉でのグルコースととして知られているインスリンのない状態で脂肪組織の増加取り込み結果からインスリン模倣プロパティ9。以前は、GLUT410の移行プロセスを定量化する蛍光顕微鏡ベースのアプローチを実施します。このアッセイを用いた抽出ライブラリ11からの多くの植物エキスの分析は、有望な候補者の特定につながった。しかし、生きている有機体にさらにテストが必要です。本稿では、変更されたニワトリ胚モデルで詳細に記載されているアプローチは、インスリン模倣性物質を識別するための有望なモデルであること証明しています。体外と体内の研究の広いギャップをうめる魅力的なツールを表し、受諾可能な費用、単純な処理の手順、および十分なスループット レートなど既存システムに比べていくつかの利点を提供しています。さらに、倫理委員会の許可は必要ありません。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">Biochrom</td>
			<td style="width:123px;">L1825</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovoRapid</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>8-0905-82-304-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td>
			<td>Local Breeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check performa</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check Inform II Teststreifen</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>5942861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator&#160; HEKA- Turbo 288</td>
			<td>HEKA Brutger&#228;te</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe Omnican F 1 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>09161502S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extracts</td>
			<td>PEKISH extract library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp Tempo Nr. 119</td>
			<td>ORBAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

2 型糖尿病 (2 型糖尿病)、複雑で多因子代謝病の高血糖値は、インスリン抵抗性と β 細胞の障害によって引き起こされます。2 型糖尿病を治療したり、少なくとも症状を減らすインスリンの注射またはインスリン増感薬の使用を含む様々 な戦略を追求しました。さらに、ハーブの化合物のアプリケーションはますます注目を集めています。したがって、効率的なテスト システムを識別し、特徴付けるインスリン模倣化合物を見つけることが必要です。ここでは、合成化合物やハーブエキス インスリン模倣性のテストを可能にする変更されたニワトリ胚モデルを開発しました。我々 は、細胞内のグルコースの増加につながる主にハーブ抽出物、化合物を識別するためができた画面を使用して蛍光顕微鏡によるプライマリ、グルコーストランスポーター 4 (Glut4) プラズマ膜への転流を定量化します。脂肪細胞中の濃度。ただし、生きている有機体で検証と、これらの物質の効果がさらに必要です。したがって、彼らの血ブドウ糖を減らすプロパティを識別するのにovo でアプローチを使用しました。萌芽期の開発の最初 3 分の 2 の中に鶏の胚の使用は動物実験とは見なされませんので、倫理委員会の承認は必要ありません。ここでは、このモデルのアプリケーションは、詳細で説明されます。

Gluc HET アプローチの説明:
興味の物質とインキュベーション後、受精卵が開かれ、卵殻 (図 2) の除去によって血のコレクションのために準備します。それ以上の準備には、平衡と漿膜へのアクセスを得るために卵殻膜の除去が含まれています。この膜は血のコレクションの適切な血管へのアクセスを提供するために慎重に切って。好ましくは、胚の腹部から大型の容器は、プラスチック製の pH ストリップに配置されます。コレクションの中に血液の希釈を避けるためには、容器と pH ストリップを乾燥ろ紙を撫でます。血管を切って、血の pH ストリップ上に漏れがピペットを使用して分析のため収集します。
選択したハーブ ・ エキスの血糖値に及ぼす影響:
最近設立された GLUT4 転流定量に基づいたプライマリ画面、インシュリン擬態特性10物質を識別することがおります。水溶性のハーブエキスの何百ものスクリーニングは、いくつかのヒットの特定につながった。これらの抽出物は、私たちの卵モデルでテストされました。Combretum 中(ラングーン クリーパー) から調製した抽出物と非開示の抽出 (抽出 0845 と呼ばれる) は、これらの実験に使用されました。HBSS バッファー 300 mg/L、判明する前の研究12,13で適切な濃度での抽出を解散しました。物質は、11 日間の培養胚に適用されました。図 3で示したように、ラングーンつるからの抽出物は重要な血ブドウ糖減少ovoでされませんでした。しかし、血中グルコース濃度は正常に低減抽出 0845、60 分後のマイナーな減少と市販インスリン アナログを使用して観測された効果に匹敵します。卵の孵化時間が延長された有意な効果が観察されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> 図 1: 有毒な化合物の胚の活力に及ぼす影響します。卵(A、C)の 11 日間の培養または別の 24 h の 10 日目に有毒なハーブエキスで治療(B、D).抽出のアプリケーションは漿尿膜(D)と(B)胚の血管の重篤な病変をもたらした。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> 図 2: ovo でモデルの説明です。左から右へ: 開口部と卵殻除去(1-2);平衡および漿膜と卵殻膜の除去公開(3)準備した容器 pH ストリップ(4);血とブドウ糖メーター (5)を用いたグルコース濃度計測のコレクションです。Haselgrueblerらから適応。 2017、12。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> 図 3: 未処理またはインスリン治療の卵と比較して血糖値に及ぼすハーブエキス。卵が 11 日間の培養し、示された物質と扱われる (市販インスリン アナログ: 3.3 U/mL; 抽出: 300 mg/L) 3 h まで血液の血糖値を血糖測定器を使用して求めた HBSS バッファー (300 μ L ボリューム) に解散。バッファーの効果がなければ結果が表示されます。誤差範囲は、平均値の標準誤差に基づいています。* P < 0.05 と * * * P < 同じインキュベーション時間 HBSS 処理卵に関して 0.0001、大幅な減少します。Haselgrueblerらから適応。 2017、12。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

本研究では生きている有機体でインスリン模倣化合物をテストする有望なツールとしてovo でシステムについて説明します。主な利点は、十分なスループット率とインスリン模倣性の植物化学物質の同定を可能にする受諾可能な費用に含まれます。

インスリン模倣化合物のテスト用のOvo でモデル

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Insulin and Hypoglycemic Drugs

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9.6K ビュー.  University of Applied Sciences Upper Austria. 本研究では生きている有機体でインスリン模倣化合物をテストする有望なツールとしてovo でシステムについて説明します。主な利点は、十分なスループット率とインスリン模倣性の植物化学物質の同定を可能にする受諾可能な費用に含まれます。

ビデオ: An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

神経科学

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

小動物の慢性神経録音用超軽量電動マイクロドライブの設計およびアセンブリ

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

ラットの急性脳卒中後の脳回復を評価する前臨床モデル

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used to improve understanding of brain circuits and their functions. The AAV-mediated manipulation of specific cell populations and/or of precise molecular components has been tremendously useful to identify new sleep regulatory circuits/molecules and key proteins contributing to the adverse effects of sleep loss. For instance, inhibiting activity of the filamentous actin-severing protein&#160;cofilin&#160;using AAV prevents sleep deprivation-induced memory impairment. Here, a protocol is&#160;described that combines the manipulation of cofilin function in a cerebral cortex area with the recording of ECoG activity to examine whether cortical cofilin modulates the wakefulness and sleep ECoG signals. AAV injection is performed during the same surgical procedure as the implantation of ECoG and electromyographic (EMG) electrodes in adult male and female mice. Mice are anesthetized, and their heads are shaved. After skin cleaning and incision, stereotaxic coordinates of the motor cortex are determined, and the skull is pierced at this location. A cannula prefilled with an AAV expressing cofilinS3D, an inactive form of cofilin, is slowly positioned in the cortical tissue. After AAV infusion, gold-covered screws (ECoG electrodes) are screwed through the skull and cemented to the skull with gold wires inserted in the neck muscles (EMG electrodes). The animals are allowed three weeks to recover and to ensure sufficient expression of cofilinS3D. The infected area and cell type are verified using immunohistochemistry, and the ECoG is analyzed using visual identification of vigilance states and spectral analysis. In summary, this combined methodological approach allows the investigation of the precise contribution of molecular components regulating neuronal morphology and connectivity to the regulation of synchronized cerebral cortex activity during wakefulness and sleep.

This article describes a protocol for the manipulation of molecular targets in the cerebral cortex using adeno-associated viruses and for monitoring the effects of this manipulation during wakefulness and sleep using electrocorticographic recordings.

マウスにおけるコフィリンを標的とするアデノ関連ウイルスを用いて操作した大脳皮質領域の電気コルチコチコ

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...