Name: an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds
Uploaded: 2018-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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医学 (定刻センター) の技術革新のオーストリア研究推進機構 (ミサイルフリ ゲート艦; プロジェクト番号 850681)、大学の応用科学上オーストリア基本資金調達イニシアチブ (プロジェクト GlucoSTAR)、センターによって資金が供給されたこの作品オーバーエスターライヒ州の基本的な資金を受け取る。

EU によると、ディレクティブ 2010/63/、胚の最初 3 分の 2 の中に孵化した非鳥類胚の実験は倫理委員会の許可を必要はありません。
1. ストレージと卵の繁殖
<ol><li>地元のブリーダーから受精鶏卵 (資材表) を取得します。 注: 卵は、実験のため使用前に敷設した後は、10 日間、加湿雰囲気の 14 ° C で保存されるかもしれない。</li>
	<li>10 の 40-60% の平均湿気の 38 ° C で卵を孵化させなさいまたは 11 日インキュベーター、常に卵になります。</li>
</ol>2. 卵の選択
<ol><li>11 日間の培養後の受精卵を確認します。このステップでは、candling ライトを使用します。Candling ランプのフリンジを浸し、印肉と卵のとがった側をキャンドルします。</li>
	<li>空気の膀胱を識別するために卵の上に明るさの違いを確認します。 注: とき卵がー、卵白に暗いですが、空気の膀胱が円形より透明性の領域として表示されます。</li>
	<li>空気の膀胱の検出後に場所をマークするために、以前に適用したインクで卵に対して若干ランプを押すと。</li>
	<li>卵白と空気の膀胱の明るさの違いが表示されないこの段階で非受精の卵を除外します。</li>
</ol>3. 物質の注入
<ol><li>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) バッファーに必要な濃度の物質を希釈することによって (例えばハーブエキスやインスリン) 関心のある物質を準備します。たとえば、3.3 U/mL の市販インスリン アナログ HBSS の。</li>
	<li>選択した化合物のアプリケーションは、慎重に空気の膀胱のマークされた領域にピンセットの先の尖ったペアで卵殻をつつきます。注射器の針の直径より大きい穴を形成しません。注射器を介してついばんだの領域に関心のある物質を含む緩衝液 (300 μ L) を挿入します。 注: は、生殖不能、1 ml の使い捨て注射器、ピペット チップおよび容器を使用します。実験のための実験用の上着を着用します。</li>
	<li>物質の血ブドウ糖を減らす効果を判断するには、それぞれ 60、120、180 分の定温器に戻って卵を置きます。基底の血ブドウ糖のレベルを決定するため、少なくとも 10-15 非治療卵が含まれます。</li>
</ol>4. 毒性試験
<ol><li>24 時間選択した化合物のアプリケーション後、少なくとも 30 のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファー (全体卵殻膜をカバーするために十分な) と卵殻膜を平衡 s。</li>
	<li>離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。</li>
	<li>先の尖ったピンセットのペアで慎重に卵殻膜をやってのけます。</li>
	<li>病変の血管を確認し、ニワトリ胚の活力 (例えば運動) を確認します。 注: は、有毒なハーブ抽出の適用後重要な非重要な胚との比較のため図 1を参照してください。</li>
</ol>5、血糖値の測定
<ol><li>それぞれの時点で慎重に空気膀胱上卵殻を削除し、(全体卵殻膜をカバーするために十分な) PBS バッファーと卵殻膜を平衡します。</li>
	<li>離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。</li>
	<li>慎重に先の尖ったピンセットのペアで卵殻膜をやってのけます。</li>
	<li>カットし、漿膜マイクロ シザー、適切な血管へのアクセスを有効にするを削除します。膜を切り取り、少なくとも 2 ~ 3 cm。膜胚の不要な血液損失を避けるために自分自身のすべての大型船をカットしないでください。</li>
	<li>胚の腹部から大きな容器を探します。閉じたマイクロ ハサミで卵白からこの船を持ち上げ、プラスチック製の pH ストリップの上に置きます。マイクロはさみで開催されている容器の下で pH ストリップを移動し、引いてマイクロはさみ離れて慎重に。</li>
	<li>次の手順で血液の希釈を避けるためにピペットで漿膜の下に液体の 1-2 の mL を削除します。容器をカットする前に、容器、フィルター紙の pH ストリップを乾燥します。</li>
	<li>1 つの側面のマイクロはさみで慎重に血管をカットします。切らない血管を通じて完全に。 注: 船は約 1 mm 厚です。それはオフ ・ ストリップが空転し、採血が可能ではない、完全に船を通って切断を避けるために容器の半分以上をカットしないでください。</li>
	<li>ピペットを使用して pH ストリップに漏れの血を収集します。10 マイクロリットル血液の血糖測定器を使用してグルコース レベルを決定する必要があります。</li>
</ol>6. 統計学的評価
<ol><li>時点あたり少なくとも 10 個々 の卵の平均値を計算し、コントロール卵 (非またはバッファー処理卵) のいずれかにこれらの値を正規化します。</li>
	<li>その後、減少の割合を決定します。さらに、肯定的な制御としてインスリンを使用します。 注: は、少なくとも 3 回各実験を繰り返します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individualized+glycaemic+targets+and+pharmacotherapy+in+type+2+diabetes.">Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes.</a> Diabetes &amp; vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).</li><li>Maruthur, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Medications+as+Monotherapy+or+Metformin-Based+Combination+Therapy+for+Type+2+Diabetes:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).</li><li>Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+medication+initiation+in+newly+diagnosed+diabetes+mellitus:+quality+and+cost+implications.">Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications.</a> The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).</li><li>Martel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesogenic+and+antidiabetic+effects+of+plants+and+mushrooms.">Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms.</a> Nature reviews. Endocrinology. , (2016).</li><li>Lanzerstorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+insulin+mimetic+drugs+by+quantitative+total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).</li><li>Onur, S., St&#246;ckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Extract+Collection+Kiel+in+Schleswig-Holstein+(PECKISH)+Is+an+Open+Access+Screening+Library.">The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library.</a> Journal of Food Research. 2 (4), (2013).</li><li>Haselgrubler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluc-HET,+a+complementary+chick+embryo+model+for+the+characterization+of+antidiabetic+compounds.">Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds.</a> PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).</li><li>Stadlbauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+Characterization+of+Putative+Antidiabetic+Herbal+Extracts.">Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts.</a> PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).</li><li>Greywe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+and+robustness+of+the+hen's+egg+test+for+analysis+of+micronucleus+induction+(HET-MN):+results+from+an+inter-laboratory+trial.">Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial.</a> Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).</li><li>Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryotoxicity+of+mirtazapine:+a+study+using+Chick+Embryotoxicity+Screening+Test.">Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test.</a> Neuro endocrinology letters. 31, 8-10 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+diabetes+model+in+chick+embryos+treated+with+streptozotocin.">Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin.</a> Biological &amp; pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).</li><li>Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ヘット カム アッセイは、業界12での動物実験に広く使用されている代替試験システムです。ここで説明したovo でシステムは、ヘット カム アッセイの変更されたバージョンを表しています。元の形式で、化合物と定式化の刺激特性や血管新生14,15,16の解析を研究するヘット カム実験を行い、テスト方法を適応しています。推定されるインシュリン擬態特性12化合物。これらの実験は、動物実験とは見なされませんので、萌芽期の開発の最初 3 分の 2 の中に孵化した非鳥類胚実験ディレクティブ 2010/63/EU によると倫理委員会の許可は必要ではありません。最近の研究は、GLUT4 ベース転座プライマリ画面10での血糖値を減らすために識別されている選択したハーブ抽出物の効果を特徴付けるovo でシステムの適合性を証明している、インスリン12,13の不在。Ovo でシステムの良好なパフォーマンスのための重要なポイントがあります: 最初に、受精卵を提供する信頼できるブリーダーです。ローマン クラシック ブラウン チキンは、品種の良い選択です。第二に、毒性の実装は除外されるべき調査の複合ニーズの毒性をテストします。さらに、適切な血管の血のコレクションのための準備は重要です。血液の非推奨の損失につながるよう自体、漿尿膜内大血管の切断を避けるために重要です。さらに、船は、pH のストリップにカットは、前にそれは、なでられる乾燥ろ紙を使用して収集した血液の希釈を防止します。最後に、実験のための十分な数が重要であると表示されます。各時点の 3 倍それぞれ実験繰り返しの少なくとも 10 の卵を使用してお勧めします。
当然のことながら、この卵のアプローチのいくつかの制限があります。物質卵殻膜から吸収され、漿膜と密接な接触に入って来るまでに最大 30 分かかる、応用化合物に胚の急速な応答を定量化することはないです。さらに、いくつかの化合物は頻繁に漿尿膜の血管の病変の結果適用濃度の有毒な可能性があります。したがって、細胞毒性テスト約 24 時間のための化合物の長期培養に基づく合理的なが表示されます。最後に、化合物の応用に使用されるバッファー システム アッセイのパフォーマンスに大きな影響があるとわかった。12現在、HBSS バッファーは使用胚の血糖値に最小の効果を得られるので。
将来のアプリケーション HBSS の代替として追加のバッファー システムをテストすることがあります。さらに、コレステロール、トリグリセリド、リポタンパク質など追加の血液パラメーターにハーブ抽出物の影響は、魅力的な質問かもしれません。
Ovoの新しい体制は、動物実験を必要とせず生きている有機体でインスリン模倣の特性を持つ物質をテストする有望かつ重要なツールです。したがって、体外と体内のアプローチの間のギャップを埋めます。既存の ovo モデル システム17と比較すると我々 は 10 または孵卵 11 日に胚を使用するよう、ストレプトゾトシン (STZ) 治療で糖尿病を誘発する必要はありません。この段階でインスリン産生が開始していないが、胚は、既にインシュリン敏感です。14-17 日齢の胚が使用される17場合また、倫理委員会の許可が必要になる可能性があります。さらに、代替戦略18と比較して、化合物の応用ここで説明がより少なく有害な骨の折れる、実験のスループット レートを増加します。
まとめると、この卵のアプローチは、インスリン模倣物質の血液減少効果は生きている有機体でテストする必要がある場合は魅力的なシステムです。

糖尿病は、高血糖によって特徴付けられる代謝性疾患、インスリン分泌やインスリン アクション1の欠陥によって引き起こされます。すべての糖尿病の症例の 90% がカテゴリー 2 型糖尿病 (2 型糖尿病)、個人がほとんどインスリン欠乏2およびインスリン抵抗性を示します。いくつかの要因は、大麻の過剰摂取、加齢と運動不足に関連する特にそれらのライフ スタイルの変化など、2 型糖尿病の世界的な発生率を高めるために知られています。約 4 億人は、国際糖尿病連合 (IDF) によると世界的な糖尿病があります。この番号は、6 億3の 20 年以内に到達する予定です。
高血糖やインスリン抵抗性、高血圧、高脂血症、耐糖能異常、冠状心臓病、脳血管障害などによる糖尿病合併症は大幅に減少平均余命および品質4に します。影響を受けた個人が必要な血糖値を下げる薬物療法;しかし、メトホルミン5などの薬の使用は、しばしば劇的な副作用6,7,8関連付け。そのため、さらに安全な広く利用可能な安価な糖尿病治療のアプローチが必要です。
さまざまなハーブ化合物、エキス、植物および栄養補助食品は、様々 な細胞機能を調節することによって機能のインシュリン擬態プロパティに帰されています。重要な機能は、ブドウ糖の運送者 (GLUT4) 4 の転流の刺激細胞膜細胞内貯蔵コンパートメント、筋肉でのグルコースととして知られているインスリンのない状態で脂肪組織の増加取り込み結果からインスリン模倣プロパティ9。以前は、GLUT410の移行プロセスを定量化する蛍光顕微鏡ベースのアプローチを実施します。このアッセイを用いた抽出ライブラリ11からの多くの植物エキスの分析は、有望な候補者の特定につながった。しかし、生きている有機体にさらにテストが必要です。本稿では、変更されたニワトリ胚モデルで詳細に記載されているアプローチは、インスリン模倣性物質を識別するための有望なモデルであること証明しています。体外と体内の研究の広いギャップをうめる魅力的なツールを表し、受諾可能な費用、単純な処理の手順、および十分なスループット レートなど既存システムに比べていくつかの利点を提供しています。さらに、倫理委員会の許可は必要ありません。

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30268.02</td><td></td></tr><tr><td>NovoRapid</td><td>Novo Nordisk</td><td>8-0905-82-304-6</td><td></td></tr><tr><td>Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td><td>Local Breeder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-check performa</td><td>Roche</td><td>6454011</td><td></td></tr><tr><td>Accu-check Inform II Teststreifen</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>5942861</td><td></td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp; HEKA- Turbo 288</td><td>HEKA Brutger&amp;auml;te</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Omnican F 1 mL</td><td>Braun</td><td>09161502S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Extracts</td><td>PEKISH extract library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamp Tempo Nr. 119</td><td>ORBAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

2 型糖尿病 (2 型糖尿病)、複雑で多因子代謝病の高血糖値は、インスリン抵抗性と β 細胞の障害によって引き起こされます。2 型糖尿病を治療したり、少なくとも症状を減らすインスリンの注射またはインスリン増感薬の使用を含む様々 な戦略を追求しました。さらに、ハーブの化合物のアプリケーションはますます注目を集めています。したがって、効率的なテスト システムを識別し、特徴付けるインスリン模倣化合物を見つけることが必要です。ここでは、合成化合物やハーブエキス インスリン模倣性のテストを可能にする変更されたニワトリ胚モデルを開発しました。我々 は、細胞内のグルコースの増加につながる主にハーブ抽出物、化合物を識別するためができた画面を使用して蛍光顕微鏡によるプライマリ、グルコーストランスポーター 4 (Glut4) プラズマ膜への転流を定量化します。脂肪細胞中の濃度。ただし、生きている有機体で検証と、これらの物質の効果がさらに必要です。したがって、彼らの血ブドウ糖を減らすプロパティを識別するのにovo でアプローチを使用しました。萌芽期の開発の最初 3 分の 2 の中に鶏の胚の使用は動物実験とは見なされませんので、倫理委員会の承認は必要ありません。ここでは、このモデルのアプリケーションは、詳細で説明されます。

Gluc HET アプローチの説明:
興味の物質とインキュベーション後、受精卵が開かれ、卵殻 (図 2) の除去によって血のコレクションのために準備します。それ以上の準備には、平衡と漿膜へのアクセスを得るために卵殻膜の除去が含まれています。この膜は血のコレクションの適切な血管へのアクセスを提供するために慎重に切って。好ましくは、胚の腹部から大型の容器は、プラスチック製の pH ストリップに配置されます。コレクションの中に血液の希釈を避けるためには、容器と pH ストリップを乾燥ろ紙を撫でます。血管を切って、血の pH ストリップ上に漏れがピペットを使用して分析のため収集します。
選択したハーブ ・ エキスの血糖値に及ぼす影響:
最近設立された GLUT4 転流定量に基づいたプライマリ画面、インシュリン擬態特性10物質を識別することがおります。水溶性のハーブエキスの何百ものスクリーニングは、いくつかのヒットの特定につながった。これらの抽出物は、私たちの卵モデルでテストされました。Combretum 中(ラングーン クリーパー) から調製した抽出物と非開示の抽出 (抽出 0845 と呼ばれる) は、これらの実験に使用されました。HBSS バッファー 300 mg/L、判明する前の研究12,13で適切な濃度での抽出を解散しました。物質は、11 日間の培養胚に適用されました。図 3で示したように、ラングーンつるからの抽出物は重要な血ブドウ糖減少ovoでされませんでした。しかし、血中グルコース濃度は正常に低減抽出 0845、60 分後のマイナーな減少と市販インスリン アナログを使用して観測された効果に匹敵します。卵の孵化時間が延長された有意な効果が観察されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> 図 1: 有毒な化合物の胚の活力に及ぼす影響します。卵(A、C)の 11 日間の培養または別の 24 h の 10 日目に有毒なハーブエキスで治療(B、D).抽出のアプリケーションは漿尿膜(D)と(B)胚の血管の重篤な病変をもたらした。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> 図 2: ovo でモデルの説明です。左から右へ: 開口部と卵殻除去(1-2);平衡および漿膜と卵殻膜の除去公開(3)準備した容器 pH ストリップ(4);血とブドウ糖メーター (5)を用いたグルコース濃度計測のコレクションです。Haselgrueblerらから適応。 2017、12。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> 図 3: 未処理またはインスリン治療の卵と比較して血糖値に及ぼすハーブエキス。卵が 11 日間の培養し、示された物質と扱われる (市販インスリン アナログ: 3.3 U/mL; 抽出: 300 mg/L) 3 h まで血液の血糖値を血糖測定器を使用して求めた HBSS バッファー (300 μ L ボリューム) に解散。バッファーの効果がなければ結果が表示されます。誤差範囲は、平均値の標準誤差に基づいています。* P < 0.05 と * * * P < 同じインキュベーション時間 HBSS 処理卵に関して 0.0001、大幅な減少します。Haselgrueblerらから適応。 2017、12。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

本研究では生きている有機体でインスリン模倣化合物をテストする有望なツールとしてovo でシステムについて説明します。主な利点は、十分なスループット率とインスリン模倣性の植物化学物質の同定を可能にする受諾可能な費用に含まれます。

インスリン模倣化合物のテスト用のOvo でモデル

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Insulin and Hypoglycemic Drugs

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9.7K ビュー.  University of Applied Sciences Upper Austria. 本研究では生きている有機体でインスリン模倣化合物をテストする有望なツールとしてovo でシステムについて説明します。主な利点は、十分なスループット率とインスリン模倣性の植物化学物質の同定を可能にする受諾可能な費用に含まれます。

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与<em&gt; ex vivoで</em&gt;生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

生物工学

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

生物学

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

ハイコンテンツ<em&gt;インビトロ</em&gt;膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

医学

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that involves measurement of blood glucose levels over time following a single intraperitoneal injection of insulin. Given that it is performed in the conscious state and blood is often collected via a tail snip, it has the potential to elicit a stress response from animals due to anxiety associated with handling and blood collection. As such, a stress-induced rise in blood glucose can occur, making it difficult to detect and interpret the primary endpoint measure, namely an insulin-mediated reduction in blood glucose. This has been seen in many mouse strains, and is quite common in diabetic db/db mice, where glucose levels can increase, rather than decrease, after insulin administration. Here, we describe a method of acclimating mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test. We find that this lowers stress-induced hyperglycemia and results in data that more accurately reflects whole body insulin sensitivity.

Stress-induced elevations in glucose levels can confound interpretation of data derived from a conscious intraperitoneal insulin tolerance test in mice. In this article, we describe a method to acclimate the mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test in order to limit stress-induced hyperglycemia.

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

インスリン刺激に対するグルコース取り込み測定と応答<em&gt;インビトロ</em&gt;培養ヒト初代筋管

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

インスリン模倣化合物のテスト用のOvo でモデル

要約

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無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与

インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

ハイコンテンツ

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリンシグナルを勉強

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

インスリン刺激に対するグルコース取り込み測定と応答

共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

インスリン模倣化合物のテスト用のOvo でモデル

要約

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無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与

インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

ハイコンテンツ

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

インスリン刺激に対するグルコース取り込み測定と応答

共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリンシグナルを勉強