この方法は、肝臓癌組織由来の小さな細胞外小胞を、古典的な差動超遠心分離によって達成されるものよりも高い純度で単離することを可能にする。この技術は、シンプルで便利で操作が簡単で、小さな細胞外小胞の研究に方法論的サポートを提供できます。まず、80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出します。
アイスボックス上の10センチの細胞培養皿に約400ミリグラムの組織を入れ、メスで細かく刻みます。組織を1.5ミリリットルの消化液を含む6ウェルプレートに移します。次に、プレートを転移脱色シェーカーに置き、摂氏37度で20分間インキュベートして、肝臓がん組織を完全に解離させ、小さな細胞外小胞(sEV)を放出します。
インキュベーション後、6ウェルプレートをアイスボックスに置きます。80マイクロリットルのホスファターゼ阻害剤と200マイクロリットルの完全プロテアーゼ阻害剤溶液を加えて消化を停止します。次に、消化液を2ミリリットルの遠沈管に置いた70マイクロメートルのセルストレーナーに移し、ゆっくりとろ過して大きな組織の破片を取り除きます。
ろ液を500gで10分間遠心分離して小さな組織片を取り除き、新しい2ミリリットルの遠沈管に上清を回収します。上清を3, 000 gで20分間遠心分離して、細胞破片を除去します。ピペットの先端が底部の白い破片に触れるまで、上清を新しい遠心チューブに慎重に移します。
残りの液体の遠心分離を繰り返した後、破片を乱すことなく上清をチューブにプールします。回収した上清を12, 000 gで20分間遠心分離し、900マイクロリットルの上清を4.7ミリメートルの超遠心管に移します。残りの液体の遠心分離を繰り返し、両方の上清を集めて同じ超遠心チューブに混合します。
チューブをPBSで完全に満たします。上清を100, 000 gで60分間遠心分離します。上清を廃棄した後、超遠心チューブにPBSを充填してペレットを再懸濁する。
100, 000gで60分間遠心分離を繰り返した後、ペレットを50マイクロリットルのPBSで再懸濁する。1ミリリットルの滅菌シリンジでsEV懸濁液を吸引し、0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターを通して600マイクロリットルの遠沈管にろ過します。さらなる分析のために、ろ液を摂氏80度で保管してください。
ナノ粒子フローサイトメーターを使用して、sEVのサイズ分布と純度を測定します。洗浄液の量を確認してください。次に、シースと廃液のレベルの違いに注意してください。
機器の主電源を20秒間オンにした後、コンピューターの電源を入れます。ソフトウェアを実行するには、機器が正しく接続されていることを示すビープ音が鳴るのを待ちます。[スタートアップ]をクリックして、カメラ、レーザー、エアポンプの電源を入れます。
次に、シースフローをクリックし、起動を選択します。4 分後、[サンプルとブースト] をクリックし、[サンプルでアンロード] を選択します。30秒後、ブランクチューブをローディングプラットフォームに置きます。
[サンプル] をクリックし、[ブースティング] を選択して、[サンプルでアンロード] を選択します。次に、超純水の入ったチューブを荷台に置きます。同時に、[サンプル]と[ブースト]をクリックし、続いて[シースフロー]と[パージ]をクリックします。
手動操作をクリックし、粒子濃縮チューブをローディングプラットフォームに置きます。次に、[サンプル]をクリックし、[1分間ブースト]を選択し、同時に[サンプル情報]で250ナノメートルの標準蛍光シリカナノスフィアの品質管理を選択します。[サンプルからのサンプリング]を選択し、SPCMをクリックして検出器をオンにします。
次に、[自動サンプリング]をクリックし、[サンプリングセット]に1.0と入力して、圧力を1キロパスカルに固定します。ツールバーをクリックし、[大信号]を選択します。レーザーの水平位置を調整し、レーザーを2マイクロメートルに設定します。
次に、LとRを継続的にクリックして、信号が強く均一であることを確認します。[記録する時間]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データを Nfa ファイルに保存し、[サンプル] をクリックして [アンロード] を選択します。
洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置きます。[サンプル]をクリックし、[ブースト]を選択し、1分後に[サンプル]と[アンロード]をクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。
粒子サイズの標準チューブをローディングプラットフォームに置き、サンプルブーストを1分間クリックします。サンプル情報で68〜155 S16M-Exo品質管理を選択し、[サンプル]、[サンプリング]の順にクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。
[記録する時間]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データを Nfa ファイルに保存し、[サンプル] をクリックして [アンロード] を選択します。洗浄液で残留物を除去した後、PBSチューブをローディングプラットフォームに置き、粒子サイズ標準チューブについて実証された手順を実行します。
次に、前に示したようにキャピラリーチップを洗浄し、sEVサンプルをロードして、粒子サイズ標準チューブについて前述のデータを分析します。精製したsEVを透過型電子顕微鏡で調べたところ、カップ状の形態を持つsEVの存在が明らかになりました。sEVのフローサイトメトリーを実施した。
また、粒子サイズは40〜200ナノメートルの範囲であり、平均粒子サイズは89ナノメートルでした。濃縮されたsEVの純度は68.32%であることが判明しましたCD63、CD9、TSG101などのsEVのタンパク質マーカーはウェスタンブロットによって検出されました。GM130はsEVの陰性対照マーカーとして使用され、組織細胞には見られましたが、sEVには見られませんでした。
酵素消化、示差超遠心、膜ろ過のステップは、小さな細胞外小胞の純度を確保するために細心の注意を払って実行することが重要です。
