本日、MRGPRX2受容体とも呼ばれるマス関連Gタンパク受容体X2である最近発見されたマスター受容体に対して、ペプチドライブラリーをスクリーニングする方法を実証する。マスト細胞は免疫系の不可欠な部分であり、自然免疫応答と適応免疫応答の両方で重要な役割を果たします。マスト細胞は、抗原結合型Fc εR1受容体、または最近発見されたX2受容体のいずれかによって活性化される。
表面結合型X2受容体の活性化は、いくつかの免疫学的、および炎症疾患にリンクされており、したがって、この受容体のリガンドへの結合機構を理解することが重要である。そのために、小ペプチド分子のライブラリーを開発し、ヘキシスで過剰発現するX2受容体に対してスクリーニングを行っています。研究では、ペプチドライブラリーは、アラニンスキャン、およびアミノ酸トランケーションのシンプルで汎用性の高い技術を使用して構築されました。
Heck293は、ペプチドとワイドタイプのヘキシスで活性化されたときにX2受容体を発現し、対照として使用したと述べている。切り捨て時のリリースでは、X2ベースの活性化を研究するために監視された。実験的に、Fura-2 AMカルシウム感受性染料は340ナノメートルと380ナノメートルで励起され、放出は510ナノメートルで記録されています。
カルシウム結合の際、蛍光強度は340で増加し、380ナノメートルの蛍光強度は減少する。次いで、340で蛍光強度の比で、380ナノメートルの蛍光強度の割合で染料が堆積する。340の380比は、細胞内カルシウムに比例し、その値を、Grynkiewicz式によって計算することができる。
2つの蛍光強度のタブビン率は、希釈、光漂白、染料漏れ、香りの密度などの実験的要因の効果が検出されます。それでは、これ以上遅滞なく、実験を始めましょう。マスト細胞MRGPR X2受容体のリガンドを同定するために、ジェネレータN-切り捨て、C切り捨て、およびN+C切り捨てペプチドライブラリーを、パム-12ミスプロチミストのN末端、C末端、およびN+C末端アミノ酸を切り詰めることによって。
ペプチドを合成するために固相ペプチド合成を使用します。.終点端子を設定された潮汐グループに、C端子をアミドグループに変更します。生成およびアラニンは、ペプチドライブラリーを、アラニンによってpam−12のそれぞれのアミノ酸を置換することによって、一度に1つずつすることができる。
終端をセタイドグループに、C端子をアミドグループに変更します。高グルコースDMEMを補うことによって培地を調製し、10%のウシ胎児血清、2ミリモルL-グルタミン、ペニシリン1ml当たり百単位、および100マイクログラム、ストレプトマイシンの1mlあたり。ティーの細胞は、形質の高い培養物、摂氏37度、5%CO2で375の培養フラスコに加えて、彼らは75〜80%コンフルエントであるまで。
一度75%コンフルエント,細胞を洗浄し、2〜3 mlのプルーフCを加え、細胞を取り外します。セルが切り離されたら、Proof-C のセルを収集します。新鮮な培地を6~9ml加えます。
1620gで細胞を3〜5分間遠心分離する。遠心分離後、上清を捨ててペレットを回収する。新鮮な培地で細胞を再懸濁する。
所望の濃度に従って、細胞を希釈する。200,000個の細胞の濃度を有する細胞懸濁液の200マイクロリットルで、各ウェルにアンボンを注ぎ、ウェルあたり40,000個の細胞を求める。37°C、5%CO2インキュベーターで24時間細胞をガードします。
実験には、Fura-2 AM色素を使用してください。50マイクログラムFura-2 AMに50マイクロリットルDMSOを加え、Fura-2 AM色素のミリモルスターク溶液を1個用意します。新鮮な培地1mlあたり1ミリモルフラ-2 AM色素の1マイクロリットルを加え、1マイクロモル色素濃度の希釈培地を調製する。
インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、培地を捨てます。培地を新鮮な希釈培地に交換してください。各ウェルに希釈媒体の200マイクロリットルを追加します。
30〜40分間、37°C、5%CO2インキュベーターでインキュベートします。細胞がインキュベートされている間に、プレートリーダーをセットします。温度を摂氏37度に設定します。
設定で、フレックスを選択します。読み取りモードを蛍光と底読みに設定します。波長で、波長の数を 2 に設定します。
励起を340ナノメートルと380ナノメートルに設定します。放出を 510 ナノメートルに設定します。感度は [既定] のままにします。
[タイミング] で、間隔を 3.9 秒に設定します。[実行時間] を 94 秒に設定すると、25 個の読み取り数が取得されます。次にアッセイプレートタイプを選択します。
次に、読み取るウェルを選択します。[複合転送]で、転送を 1 に設定し、初期ボリュームを 100 マイクロリットルに設定します。ピペットの高さを100マイクロリットル、体積を50マイクロリットルに、タイムポイントを36秒に設定して化合物を追加し、読み取りを傾向があります。
次に、複合ソースプレートタイプを選択します。三国酸塩は使用しないままにします。[ヒントとピペットのヒントのレイアウト]を選択します。
複合列とチップ列の場合、化合物は複合プレートの 1 列目で転送されます。[先端列]を 1 に設定し、[複合列]を 1 に設定します。[自動調整]を[オン]にします。40分間のインキュベーションの後、培地を取り出します。
XDBバッファで細胞を洗います。蛍光読み取り用にXDBバッファを100マイクロリットル追加します。蛍光の読書のためのプレートを取ります。
プリチェットが摂氏37度に達したら、読み取りチャンバーを押して、蛍光プレートリーダーにアッセイプレートを入れる。ソースを押して、コンパウンドプレートを入れます。X溶液を回すために尊敬ペプチドイオノミシンおよびEGTAの200マイクロリットルを加えることによって化合物プレートを準備する。
チッププラットを押してチップボックスを置きます。黒い先端を使用して、自己蛍光を避けます。プレートが保持されたら、ソフトウェアの設定を使用して Read を押します。
グリンキエヴィチ方程式により蛍光比からカルシウム濃度を決定します。示されているのは、パム良いペプチドの蛍光データである。見られるように、36秒でペプチド添加後、340ナノメートルで蛍光が増加し、380ナノメートルの記録が低下するとルーカーが増加する。
データは340の比で表され、380シグナルの比と見なされる。それらは、ペプチド付加後に増加するシグナルを示す。この図は、活性化ペプチドの代表的なデータである。
図Aは、活性化ペプチドに対する蛍光シグナルを示す。表代表データは、adoによって示されるように、圧痛サイクルのベースラインを作成した後に追加されたcram12ペプチドに対応する。図Bは、340ナノメートルでの励起後の蛍光発光の比を、380ナノメートルで励起した後の蛍光発光の比率を示す。
この図は、ブランクの代表データです。図Aは、ブランクに対する蛍光信号を示す。HTBは、adoによって示されるように10の供給サイクルのためのベースラインを希釈した後に添加した。
図Bは、380ナノメートルでの励起後の蛍光放射の340ナノメートルの励起後の蛍光放射の配給を示す。この図は、染料校正の規格の代表的なデータです。図Aは、カシェム結合状態で最大蛍光を得るためにadoによって示されるように、10回目の測定値でイオノマイシンを添加したことを示す。
EGPAトリトンX00は、最小信号を得るadoによって示されるように、20の読み取り値の後に追加されました。図Bは、380ナノメートルでの励起後の蛍光放射と蛍光放射の340ナノメートルの励起後の蛍光放射の比率を示す。これらの値は、濃度の細胞内キャッシュを取得するためにGrynkiewicz方程式にさらに入れられます。
この図は、代表的なペプチドの配列と純度を確認するための特性を示しています。図Aは、代表ペプチド配列WNK WALの縦質量が857.90染色薄化であったを示す。これは、質量分光法におけるZed比に対するNによって示される。
図Bは、HPLCにより確認された99%のペプチド純度を示す。このペプチドは、N+C切り捨てられたペプチドライブラリーに属する。結論として、ここで説明する方法は、カルシウムベースの最後のスクリーニングのために効率的かつ明るくすることができる簡単で汎用性です。
しかし、データの品質を決定するいくつかの要因があるため、特定のセル計器システムに合わせて構成を最適化する必要があります。ありがとうございました。
