このプロトコルは、吸着タンパク質層上で培養されたレポーターマクロファージにおけるNF-κ-BおよびAP-1活性の迅速な評価と、Toll様受容体のような細胞シグナル伝達経路の寄与を、その応答に可能にする。この技術の主な利点は、そのシンプルさであり、細胞培養上清を簡単な酵素アッセイを使用してNF-kappa-BおよびAP-1活性について迅速に分析することが可能です。ヒュームフードの20ミリリットルガラスシンチレーションバイアルで、1ミリリットルの最終濃度で20ミリグラムのクロロホルムでPMMAを溶解させることから始めます。
バイアルに磁気攪拌棒を入れ、混合物を少なくとも2時間かき混ぜます。すべての固形物が溶解したら、PMMA溶液の400マイクロリットルをスピンコート機上の計画状態ごとに各ホウケイ酸ガラス顕微鏡スライドの中央に移し、PMMAを1分間に3,000回転でスライドに2分間回転させます。その後、スピンコートスライドを70%エタノールスプレークリーンボックスに保管します。
次に、生物学的安全キャビネットで、無菌鉗子と無菌技術を使用して、8チャンバーの粘着性のある井戸をPMMAコーティングスライドに取り付け、各粘着性の上部にしっかりと押し付けて強く取り付けられていることを確認します。すべてのウェルがスライドに取り付け、漏れないように、粘着井戸を顕微鏡スライドの端に並べるように注意してください。シールを固定するために一晩摂氏37度で粘着性のよく取り付けられたスライドをインキュベートします。
その後、200マイクロリットルの細胞培養グレードの内毒素フリー水を各井戸に加え、室温で60分間インキュベーションし、翌朝シールをテストします。インキュベーションの終わりには、水を吸引し、PMMAコーティングを乱さないように注意する。1回1時間、300マイクロリットルの新鮮な内毒素フリー水で3回、残りの溶剤を除去するために使用する前に12時間と1回24時間洗浄します。
その後、30分間のスライドをUV殺菌します。3T3細胞ライセートを得るために、3T3細胞培養がT150培養フラスコで70%合流に達すると、各培養物を5ミリリットルのPBSで洗浄し、37°Cの酵素フラスコ当たり5ミリリットルの細胞を3〜5分間摂氏37度で処理する。インキュベーションの終わりに、各フラスコを数回ゆっくりと前後に傾けて細胞を取り外してから、培養ごとに5ミリリットルのPBSで酵素を中和する。
解約した細胞を単一の50ミリリットル遠心分離チューブにプールし、ピペットを使用して細胞の塊を分解します。カウント後、遠心分離により細胞を採取する。上清を吸引し、新鮮なPBS中で1ミリリットル濃度当たり6細胞に1回10回で細胞を再懸濁した。
その後、完全に解凍されるまで37°Cの水浴に凍結細胞溶液を置く前に、サンプルが完全に凍結されるまで少なくとも2時間マイナス80度の摂氏冷凍庫で細胞を凍結します。トール様受容体媒介性NF-κ-B/AP-1活性に対する吸着タンパク質層の影響を評価するために、適切なサイズのフラスコでレポーターマクロファージを70%合流に成長させた後、示すように適切な酵素解離溶液で細胞を取り外す。アッセイ培地中の1ミリリットル当たり5個の細胞に対して7.3倍10倍の細胞を再懸濁し、3つのチューブ間で細胞を均等にアリコートする。
TLR4阻害剤の1ミリリットル当たり1マイクログラムの細胞の最初のチューブを室温で60分間処理し、抗TLR2抗体を1ミリリットル当たり50マイクログラムで室温で30分間処理し、3番目のチューブを室温で放置します。細胞がインキュベートしている間に、200マイクロリットルのライセートと10%の牛血清を条件ごとに3つの粘着性の井戸に加えます。各ウェルに新しいパスツールピペットでタンパク質溶液を吸引し、粘着性の井戸表面を1回の洗浄ごとに5分間PBSあたり250マイクロリットルで3回洗浄する前に、タンパク質を適切な実験期間に摂氏37度で吸着させます。
レポーターマクロファージ治療の最後に、各ウェルに200マイクロリットルの細胞溶液を加える。Pam3CSK4を、図示に示すように、TLR2陽性対照として2つのウェルに1ミリリットル当たり150ナノグラムの最終濃度に加えます。TLR4陽性対照の場合、2つのウェルに1ミリリットル当たり1.5マイクログラムの最終濃度にリポ多糖を加えます。
摂氏37度で20時間後、各ウェルから20マイクロリットルの上澄み物を96ウェルプレートに重ね、バックグラウンドコントロールと同様に20マイクロリットルのアッセイ媒体を含む3つの井戸を含む。次に、各ウェルに200マイクロリットルのSEAPレポーターアッセイ試薬を加え、37°Cで2時間半のインキュベーション用粘着シールでプレートを覆います。上澄み物の残りの部分を粘着性ウェルあたり1つの1.5ミリリットルチューブに移し、遠心分離によって破片を沈降させる。
その後、ELISAによる下流炎症性サイトカイン分析のために、新しい1.5ミリリットルチューブに上澄み物を移し、マイナス80°Cの貯蔵を行います。インキュベーションの最後に、プレートから粘着シールを取り出し、635ナノメートルのプラレーターリーダーで吸光度を読み取ります。PMMAコーティングされた顕微鏡は1時間70%エタノールに浸漬してPMMAコーティングを除去し、70%エタノールもUV殺菌もfPTFEコーティングカバーリップの水接触角に影響を与えません。
3T3ライセートのウェスタンブロット分析は、HMGB1とヒートショックタンパク質60の両方の存在を明らかにし、2つの十分に文書化された損傷関連分子パターンである。リセートからポリマー表面へのTLRリガンドの吸着は、タンパク質吸着ポリマー表面上でレポーターマクロファージを20時間培養し、酵素アッセイを介して間接的にNF-κ-B/AP-1活性を評価することによって確認することができる。この活性は、TLR2またはTLR4シグナル伝達の阻害に続いて減少する。
また、レポーターマクロファージは、吸着されたFBSまたは血漿と比較して吸着した糖に応答してNF-κ-B/AP-1活性を有意に増加させ、予吸着タンパク質がない。さらに、血清中に希釈された少量の溶解物は、血清単独と比較してNF-κ-B/AP-1応答を有意に増加させ、ポリマー表面に依存する最も低い有効希釈を有する。コーティングされた表面の内毒素汚染を避けるために、清潔な領域で作業し、使用していないときに表面を覆い、細胞培養グレードの水とリンス用のバッファーを使用します。
この手順に従って、残りの上清に対して免疫アッセイを行い、タンパク質分泌を評価し、マクロファージをフローサイトメトリーおよびqPCR遺伝子発現解析によって分析することができる。
