Questo protocollo consente la rapida valutazione dell'attività NF-kappa-B e AP-1 nei macrofagi reporter coltivati su strati proteici adsorbiti e il contributo delle vie di segnalazione cellulare, come i recettori simili a Toll, a tale risposta. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità, che consente di analizzare rapidamente i supernatici di coltura cellulare per l'attività NF-kappa-B e AP-1 utilizzando un semplice saggio enzimatico. Inizia sciogliendo il PMMA in cloroformio a una concentrazione finale di 20 milligrammi per millilitro in una fiala di scintillazione in vetro da 20 millilitri in una cappa aspirante.
Posizionare una barra di agitazione magnetica nel flaconcino e mescolare la miscela per almeno due ore. Una volta sciolti tutti i solidi, trasferire 400 microlitri della soluzione PMMA al centro di ogni vetrino in vetro borosilicato per condizione pianificata su uno spin coater e ruotare il PMMA sullo scivolo per due minuti a 3.000 rotazioni al minuto. Quindi conservare le diapositive rivestite di spin in una scatola pulita spruzzata con etanolo al 70%.
Successivamente, in un armadio di sicurezza biologico, utilizzare forcep sterili e tecnica aseptica per attaccare pozzi appiccicosi a otto camere alle diapositive rivestite in PMMA, premendo saldamente sulla parte superiore di ogni pozzo appiccicoso per assicurarsi che siano fortemente attaccati. Fare attenzione a allineare i pozzi appiccicosi con i bordi dello scivolo del microscopio in modo che tutti i pozzi si attacchino allo scivolo e non perdano. Incubare gli scivoli appiccicosi ben attaccati a 37 gradi Celsius durante la notte per fissare le guarnizioni.
Quindi aggiungere 200 microlitri di acqua priva di endotossine di grado coltura cellulare a ciascun pozzo per un'incubazione di 60 minuti a temperatura ambiente per testare le guarnizioni la mattina successiva. Al termine dell'incubazione, aspirare l'acqua, facendo attenzione a non disturbare il rivestimento PMMA. Lavare ogni pozzo tre volte con 300 microlitri di acqua fresca endotossina per un'ora per lavaggio seguita da un lavaggio di 12 ore e uno di 24 ore prima dell'uso per rimuovere qualsiasi solvente rimanente.
Quindi sterilizzare i raggi UV per 30 minuti. Per ottenere liscivi cellulari 3T3, quando le colture cellulari 3T3 raggiungono il 70% di confluenza nei contenitori di coltura T150, lavare ogni coltura con cinque millilitri di PBS e trattare le cellule con cinque millilitri di enzima di dissociazione cellulare ricombinante privo di origine animale per pallone a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, inclinare delicatamente ogni pallone avanti e indietro alcune volte per staccare le cellule prima di neutralizzare l'enzima con cinque millilitri di PBS per coltura.
Mettere in comune le cellule dissociate in un singolo tubo di centrifuga da 50 millilitri e utilizzare una pipetta per rompere eventuali grumi cellulari. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule per centrifugazione. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule ad una concentrazione di uno per 10 a sei cellule per millilitro in PBS fresco.
Quindi congelare le cellule in un congelatore Celsius meno 80 gradi per almeno due ore fino a quando il campione non è completamente congelato prima di posizionare la soluzione cellulare congelata in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi fino a quando non viene completamente scongelato. Per valutare gli effetti di uno strato proteico adsorbito sull'attività NF-kappa-B/AP-1 mediata dal recettore simile a Toll, dopo aver fatto crescere i macrofagi reporter in un pallone di dimensioni appropriate al 70% di confluenza, staccare le cellule con un'appropriata soluzione di dissociazione enzimatica come dimostrato. Resopendare le cellule a una concentrazione di 7,3 per 10 per millilitro nel mezzo di dosaggio e aliquota uniformemente le cellule tra tre tubi.
Trattare il primo tubo di cellule con un microgrammo per millilitro di inibitore TLR4 per 60 minuti a temperatura ambiente, trattare il secondo tubo con 50 microgrammi per millilitro di anticorpo anti-TLR2 per 30 minuti a temperatura ambiente e lasciare il terzo tubo a temperatura ambiente senza trattamento. Durante l'incubazione delle cellule, aggiungere 200 microlitri di lisato e il 10% di siero bovino fetale a tre pozzi appiccicosi per condizione. Lasciare adsorbire le proteine a 37 gradi Celsius per l'appropriato periodo sperimentale prima di aspirare le soluzioni proteiche con una nuova pipetta Pasteur per ogni pozzo e lavare le superfici appiccicoso del pozzo tre volte con 250 microlitri di PBS per pozzo per cinque minuti per lavaggio.
Alla fine del trattamento con macrofagi reporter, aggiungere 200 microlitri di soluzione cellulare ad ogni pozzo. Aggiungere Pam3CSK4 a una concentrazione finale di 150 nanogrammi per millilitro a due pozzi come controllo positivo TLR2 come illustrato nello schema. Per un controllo positivo TLR4, aggiungere lipopolysaccharide a una concentrazione finale di 1,5 microgrammi per millilitro a due pozzi.
Dopo 20 ore a 37 gradi Celsius, piastra 20 microlitri di supernatante da ogni pozzo in duplicato in una piastra da 96 po ', inclusi tre pozzi con 20 microlitri di mezzo di dosaggio per così come il controllo dello sfondo. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di reagente del saggio del reporter PAES a ciascun pozzo e coprire la piastra con un sigillo adesivo per un'incubazione di 2 ore e mezza a 37 gradi Celsius. Trasferire il resto del supernatante in un tubo da 1,5 millilitri per pozzo appiccicoso e sedimentare i detriti mediante centrifugazione.
Quindi trasferire i supernaganti a nuovi tubi da 1,5 millilitri per uno stoccaggio di meno 80 gradi Celsius per l'analisi della citochina proinfiammatoria a valle di ELISA. Alla fine dell'incubazione, rimuovere il sigillo adesivo dalla piastra e leggere l'assorbanza su un lettore plater a 635 nanometri. Immergere i vetrini del microscopio rivestiti in PMMA in etanolo al 70% per un'ora rimuove il rivestimento PMMA, mentre né il 70% di etanolo né la sterilizzazione UV influenzano l'angolo di contatto dell'acqua dei copricapo rivestiti in fPTFE.
L'analisi western dei lysati 3T3 rivela la presenza sia di HMGB1 che della proteina shock termico 60, due modelli molecolari ben documentati associati ai danni. L'adsorbimento dei ligandi TLR dal lisato sulle superfici polimeriche può essere confermato coltivando macrofagi reporter per 20 ore sulle superfici polimeriche adsorbite dalle proteine e quindi valutando indirettamente l'attività NF-kappa-B/AP-1 attraverso un saggio enzimatico. Questa attività è ridotta a seguito dell'inibizione della segnalazione TLR2 o TLR4.
Inoltre, i macrofagi dei reporter hanno aumentato significativamente l'attività di NF-kappa-B/AP-1 in risposta al llysato adsorbito rispetto all'FBS o al plasma adsorbiti e nessuna proteina pre-adsorbita. Inoltre, piccole quantità di glisato diluito nel siero inducono risposte NF-kappa-B/AP-1 significativamente aumentate rispetto al solo siero, con la più bassa diluizione effettiva dipendente dalla superficie del polimero. Per evitare la contaminazione da endotossina delle superfici rivestite, lavorare in aree pulite, coprire le superfici quando non sono in uso e utilizzare acqua e tamponi di coltura cellulare per risciacqui.
Seguendo questa procedura, i test immunologici possono essere eseguiti sui supernagini rimanenti per valutare la secrezione proteica e i macrofagi possono essere analizzati dalla citometria del flusso e dall'analisi dell'espressione genica qPCR.
