ويمكّن هذا البروتوكول من التقييم السريع لنشاط NF-kappa-B وAP-1 في قوامات المراسلات المستزرعة على طبقات البروتين الممتزة ومساهمة مسارات إشارات الخلايا، مثل المستقبلات الشبيهة بالحصيلة، في تلك الاستجابة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها ، مما يسمح لتحليل اثقافات ثقافة الخلية بسرعة لنشاط NF-kappa-B و AP-1 باستخدام مقايسة انزيمية مباشرة. تبدأ عن طريق حل PMMA في الكلوروفورم في تركيز نهائي 20 ملليغرام لكل ملليلتر في قارورة الزجاج 20 ملليلتر متألق في غطاء للأبخرة.
ضع بار حرك مغناطيسي في القارورة، ويحرك الخليط لمدة ساعتين على الأقل. عندما تم حل جميع المواد الصلبة، نقل 400 ميكرولترات من حل PMMA على مركز كل شريحة المجهر الزجاج البورسليكات لكل حالة المخطط لها على معطف تدور، وتدور PMMA على الشريحة لمدة دقيقتين في 3، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة. ثم تخزين الشرائح المغلفة تدور في مربع نظيفة 70٪ الإيثانول رش.
بعد ذلك ، في خزانة السلامة البيولوجية ، استخدم ملقطًا معقمة وتقنية معقمة لإرفاق آبار لزجة من ثماني غرف بالشرائح المغلفة بـ PMMA ، والضغط بقوة على الجزء العلوي من كل بئر لزجة للتأكد من أنها مرتبطة بقوة. الحرص على خط حتى الآبار لزجة مع حواف الشريحة المجهر بحيث كل من الآبار نعلق على الشريحة وعدم تسرب. احتضان الشرائح اللزجة تعلق جيدا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتأمين الأختام.
ثم إضافة 200 ميكرولترات من المياه الصف endotoxin ثقافة الخلية إلى كل بئر لاحتضان 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاختبار الأختام في صباح اليوم التالي. في نهاية الحضانة، وpirate المياه، مع الحرص على عدم تعكير طلاء PMMA. اغسل كل بئر ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من المياه الطازجة الخالية من السموم لمدة ساعة واحدة لكل غسيل متبوعة بغسيل لمدة 12 ساعة و 24 ساعة قبل الاستخدام لإزالة أي مذيب متبقي.
ثم تعقيم الأشعة فوق البنفسجية الشرائح لمدة 30 دقيقة. للحصول على 3T3 خلية lysates، عندما الثقافات خلية 3T3 تصل إلى التقاء 70٪في قارورة ثقافة T150، وغسل كل ثقافة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وعلاج الخلايا مع خمسة ملليلتر من الحيوانات المنشأ، وانزيم تفكك الخلايا المؤتلف لكل قارورة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. في نهاية الحضانة، إمالة بلطف كل قارورة ذهابا وإيابا عدة مرات لفصل الخلايا قبل تحييد الانزيم مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل ثقافة.
قم بتجميع الخلايا المنفصلة في أنبوب واحد من أجهزة الطرد المركزي سعة 50 ملليلتر، واستخدم ماصة لتفريق أي كتل خلايا. بعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. التعرق، و resuspend الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الستة لكل ملليلتر التركيز في برنامج تلفزيوني جديد.
ثم تجميد الخلايا في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل حتى يتم تجميد العينة تماما قبل وضع حل الخلية المجمدة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى يذوب تماما. لتقييم آثار طبقة البروتين الممتزة على NF-kappa-B/AP-1 الشبيهة بالمستقبلات، بعد تزايد الضامة المراسلة في قارورة بحجم مناسب إلى التقاء 70٪، قم بفصل الخلايا مع حل انفصال إنزيمي مناسب كما هو موضح. resuspend الخلايا في 7.3 مرات 10 إلى الخلايا الخمسة لكل ملليلتر التركيز في المتوسطة المقايسة، و aliquot الخلايا بالتساوي بين ثلاثة أنابيب.
علاج الأنبوب الأول من الخلايا مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من مثبط TLR4 لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وعلاج الأنبوب الثاني مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة TLR2 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وترك الأنبوب الثالث في درجة حرارة الغرفة دون علاج. في حين أن الخلايا هي احتضان، إضافة 200 ميكرولترات من lysate و 10٪ مصل الأبقار الجنينية إلى ثلاثة آبار لزجة لكل حالة. السماح للبروتينات لادصاص في 37 درجة مئوية للفترة التجريبية المناسبة قبل الطامح حلول البروتين مع ماصة جديدة باستور لكل بئر وغسل الأسطح الآبار لزجة ثلاث مرات مع 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في بئر لمدة خمس دقائق لكل غسل.
في نهاية معالجة الضامة المراسل ، إضافة 200 ميكرولترات من حل الخلية إلى كل بئر. إضافة Pam3CSK4 إلى تركيز نهائي من 150 نانوغرام لكل ملليلتر إلى بئرين كتحكم TLR2 الإيجابي كما هو موضح في التخطيطي. بالنسبة لمراقبة TLR4 الإيجابية، أضف سكرايد الدهون إلى تركيز نهائي يبلغ 1.5 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى بئرين.
بعد 20 ساعة في 37 درجة مئوية، لوحة 20 ميكرولترات من كل بئر مكررة في لوحة 96-جيدا، بما في ذلك ثلاثة آبار مع 20 ميكرولترات من المتوسط المقايسة في جيدا وكذلك التحكم في الخلفية. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولترات من مُسايسة مراسل SEAP إلى كل بئر ، واغطي الطبق بختم لاصق لحضانة 2 1/2 ساعة عند 37 درجة مئوية. نقل ما تبقى من عظمى إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر في بئر لزجة، ورواسب الحطام عن طريق الطرد المركزي.
ثم نقل المنابات العملاقة إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر للتخزين ناقص 80 درجة مئوية لتحليل السيتوكين الولينلومي من قبل ELISA. في نهاية الحضانة، وإزالة ختم لاصق من لوحة، وقراءة امتصاص على قارئ لوحة في 635 نانومتر. نقع شرائح المجهر المغلفة بـ PMMA في 70٪ من الإيثانول لمدة ساعة واحدة يزيل طلاء PMMA ، في حين لا يؤثر أي من الإيثانول بنسبة 70٪ أو تعقيم الأشعة فوق البنفسجية على زاوية الاتصال بالماء من أغطية الأغطية المغلفة بـ fPTFE.
يكشف تحليل البقعة الغربية لـ 3T3 lysates عن وجود كل من HMGB1 وبروتين صدمة الحرارة 60 ، وهما نمطان جزيئيان موثقان جيدًا مرتبطان بالضرر. يمكن تأكيد الامتزاز من أربطة TLR من الليزات على أسطح البوليمر عن طريق زراعة الضامة مراسل لمدة 20 ساعة على أسطح البوليمر البروتين الممتز ومن ثم تقييم غير مباشر NF-kappa-B/AP-1 النشاط عن طريق مقايسة انزيمية. يتم تقليل هذا النشاط بعد تثبيط إشارات TLR2 أو TLR4.
وعلاوة على ذلك، زادت الضامة مراسل بشكل كبير NF-كابا-B/AP-1 النشاط ردا على lysate adsorbed بالمقارنة مع FBS أو البلازما الممتززة وعدم وجود البروتين ما قبل امتزاز. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كميات صغيرة من اللسات المخففة في المصل تحفز بشكل كبير على زيادة الاستجابات NF-kappa-B/AP-1 مقارنة بالمصل وحده، مع أدنى تخفيف فعال يعتمد على سطح البوليمر. لتجنب تلوث الأسطح المطلية، والعمل في المناطق النظيفة، وتغطية الأسطح عندما لا تكون قيد الاستخدام، واستخدام المياه الصف ثقافة الخلية والمخازن المؤقتة للشطف.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء عمليات المناعة على المناذرات المتبقية لتقييم إفراز البروتين، ويمكن تحليل الضامة عن طريق تحليل قياس التدفق الجيني وتحليل التعبير الجيني qPCR.
