Este protocolo permite la evaluación rápida de la actividad NF-kappa-B y AP-1 en macrófagos reporteros cultivados en capas de proteínas adsorbidas y la contribución de vías de señalización celular, como receptores similares a peajes, a esa respuesta. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad, permitiendo que los sobrenadantes de cultivo celular sean analizados rápidamente para la actividad NF-kappa-B y AP-1 utilizando un ensayo enzimático sencillo. Comience disolviendo PMMA en cloroformo a una concentración final de 20 miligramos por mililitro en un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros en una campana de humo.
Coloque una barra de agitación magnética en el vial y revuelva la mezcla durante al menos dos horas. Cuando todos los sólidos se hayan disuelto, transfiera 400 microlitros de la solución PMMA al centro de cada diapositiva de microscopio de vidrio borosilicato por condición planificada en una recubridora de centrifugado, y gire el PMMA a la diapositiva durante dos minutos a 3.000 rotaciones por minuto. A continuación, guarde los portaobjetos recubiertos de espín en una caja limpia pulverizada con 70% de etanol.
A continuación, en un gabinete de seguridad biológica, utilice fórceps estériles y técnica aséptica para fijar pozos pegajosos de ocho cámaras a los portaobjetos recubiertos de PMMA, presionando firmemente en la parte superior de cada pozo pegajoso para asegurarse de que están fuertemente unidos. Tenga cuidado de alinear los pozos pegajosos con los bordes de la diapositiva del microscopio para que todos los pozos se adhieran a la diapositiva y no se escapen. Incubar los portaobjetos pegajosos bien unidos a 37 grados centígrados durante la noche para asegurar los sellos.
Luego agregue 200 microlitros de agua sin endotoxinas de grado de cultivo celular a cada pozo para una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente para probar los sellos a la mañana siguiente. Al final de la incubación, aspirar el agua, teniendo cuidado de no perturbar el recubrimiento de PMMA. Lave cada pozo tres veces con 300 microlitros de agua fresca sin endotoxinas durante una hora por lavado, seguido de un lavado de 12 horas y un lavado de 24 horas antes de usarlo para eliminar cualquier disolvente restante.
A continuación, el esterilizar UV las diapositivas durante 30 minutos. Para obtener 3T3 de licatos celulares, cuando los cultivos celulares 3T3 alcancen el 70% de confluencia en los matraces de cultivo T150, lave cada cultivo con cinco mililitros de PBS y trate las células con cinco mililitros de enzima de disociación celular recombinante sin origen animal por matraz a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. Al final de la incubación, incline suavemente cada matraz hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces para separar las células antes de neutralizar la enzima con cinco mililitros de PBS por cultivo.
Agrupe las células disociadas en un solo tubo centrífugo de 50 mililitros, y use una pipeta para romper cualquier grumos celular. Después de contar, recoger las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante, y resuspender las células a una vez 10 a las seis células por mililitro de concentración en PBS fresco.
A continuación, congele las células en un congelador Celsius de menos 80 grados durante al menos dos horas hasta que la muestra esté completamente congelada antes de colocar la solución de celda congelada en un baño de agua Celsius de 37 grados hasta que se descongele por completo. Para evaluar los efectos de una capa de proteína adsorbida en la actividad NF-kappa-B/AP-1 mediada por un receptor similar al peaje, después de cultivar macrófagos reportero en un matraz de tamaño adecuado a una confluencia del 70%, desvinde las células con una solución de disociación enzimática adecuada como se ha demostrado. Resuspender las células a una 7,3 veces 10 a las cinco células por mililitro de concentración en el medio de ensayo, y aliquot las células uniformemente entre tres tubos.
Tratar el primer tubo de células con un microgramo por mililitro de inhibidor TLR4 durante 60 minutos a temperatura ambiente, tratar el segundo tubo con 50 microgramos por mililitro de anticuerpo anti-TLR2 durante 30 minutos a temperatura ambiente y dejar el tercer tubo a temperatura ambiente sin tratamiento. Mientras las células están incubando, agregue 200 microlitros de izado y 10%suero bovino fetal a tres pozos pegajosos por condición. Permita que las proteínas se adsorben a 37 grados Celsius durante el período experimental adecuado antes de aspirar las soluciones proteicas con una nueva pipeta Pasteur para cada pozo y lavar las superficies pegajosas del pozo tres veces con 250 microlitros de PBS por pozo durante cinco minutos por lavado.
Al final del tratamiento de macrófagos reportero, agregue 200 microlitros de solución celular a cada pozo. Añadir Pam3CSK4 a una concentración final de 150 nanogramos por mililitro a dos pozos como un control positivo TLR2 como se ilustra en el esquema. Para un control positivo TLR4, añadir lipopolisacárido a una concentración final de 1,5 microgramos por mililitro a dos pozos.
Después de 20 horas a 37 grados Celsius, placa 20 microlitros de sobrenadante de cada pozo en duplicado en una placa de 96 pozos, incluyendo tres pozos con 20 microlitros de medio de ensayo por así como el control de fondo. A continuación, agregue 200 microlitros del reactivo de ensayo de reportero SEAP a cada pozo, y cubra la placa con un sello adhesivo para una incubación de 2 1/2 hora a 37 grados centígrados. Transfiera el resto del sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros por pozo pegajoso, y sedimente los escombros por centrifugación.
A continuación, transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de 1,5 mililitros para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius para el análisis posterior de citoquinas proinflamatorias por ELISA. Al final de la incubación, retire el sello adhesivo de la placa y lea la absorbancia en un lector de placas a 635 nanómetros. El remojo de diapositivas de microscopio recubiertos con PMMA en 70% de etanol durante una hora elimina el recubrimiento de PMMA, mientras que ni el 70% de etanol ni la esterilización UV influyen en el ángulo de contacto del agua de los cubreobjetos recubiertos con fPTFE.
El análisis de manchas occidentales de lysates 3T3 revela la presencia de HMGB1 y proteína de choque térmico 60, dos patrones moleculares bien documentados asociados al daño. La adsorción de los ligandos TLR del lisato sobre las superficies del polímero se puede confirmar cultivando macrófagos reportero durante 20 horas en las superficies de polímeros adsorbidos por proteínas y luego evaluando indirectamente la actividad NF-kappa-B/AP-1 a través de un ensayo enzimático. Esta actividad se reduce tras la inhibición de la señalización TLR2 o TLR4.
Además, los macrófagos de reportero han aumentado significativamente la actividad de NF-kappa-B/AP-1 en respuesta al izado adsorbido en comparación con FBS o plasma adsorbido y ninguna proteína pre-adsorbida. Además, pequeñas cantidades de izado diluido en suero inducen un aumento significativo de las respuestas de NF-kappa-B/AP-1 en comparación con el suero solo, con la dilución efectiva más baja que depende de la superficie del polímero. Para evitar la contaminación por endotoxinas de las superficies recubiertas, trabaje en áreas limpias, cubra las superficies cuando no esté en uso y utilice agua de grado de cultivo celular y tampones para enjuagues.
Después de este procedimiento, se pueden realizar inmunoensayos en los sobrenadantes restantes para evaluar la secreción de proteínas, y los macrófagos se pueden analizar mediante citometría de flujo y análisis de expresión génica qPCR.
