Ce protocole permet l’évaluation rapide de l’activité NF-kappa-B et AP-1 chez les macrophages de journalistes cultivés sur des couches de protéines adsorbed et la contribution des voies de signalisation cellulaire, comme les récepteurs toll-like, à cette réponse. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité, permettant aux supernatants de culture cellulaire d’être rapidement analysés pour l’activité NF-kappa-B et AP-1 à l’aide d’un essai enzymatique simple. Commencez par dissoudre la PMMA en chloroforme à une concentration finale de 20 milligrammes par millilitre dans un flacon de scintillation en verre de 20 millilitres dans un capot de fumée.
Placer une barre magnétique dans le flacon et remuer le mélange pendant au moins deux heures. Lorsque tous les solides ont été dissous, transférez 400 microlitres de la solution PMMA au centre de chaque glissière de microscope en verre borosilicate par condition planifiée sur un revêtement de spin, et faites tourner la PMMA sur la lame pendant deux minutes à 3000 rotations par minute. Rangez ensuite les glissières enduire de spin dans une boîte propre pulvérisée à 70 % d’éthanol.
Ensuite, dans une armoire de sécurité biologique, utilisez des forceps stériles et une technique aseptique pour attacher des puits collants de huit chambre aux glissières enduites pmma, en appuyant fermement sur le dessus de chaque puits collant pour s’assurer qu’ils sont fortement attachés. Prenez soin d’aligner les puits collants avec les bords de la lame de microscope de sorte que tous les puits se fixent à la glissière et ne fuient pas. Incubez les glissières collantes bien attachées à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour fixer les joints.
Ajouter ensuite 200 microlitres d’eau sans endotoxine de qualité culture cellulaire à chaque puits pendant une incubation de 60 minutes à température ambiante pour tester les phoques le lendemain matin. À la fin de l’incubation, aspirer l’eau, en prenant soin de ne pas perturber le revêtement PMMA. Lavez chaque puits trois fois avec 300 microlitres d’eau fraîche sans endotoxine pendant une heure par lavage, suivi d’un lavage de 12 heures et d’un lavage 24 heures avant de l’utiliser pour enlever tout solvant restant.
Ensuite, les UV stérilisent les toboggans pendant 30 minutes. Pour obtenir des lysates cellulaires 3T3, lorsque les cultures cellulaires 3T3 atteignent 70 % de confluence dans les flacons de culture T150, lavez chaque culture avec cinq millilitres de PBS et traitez les cellules avec cinq millilitres d’enzymes de dissociation cellulaires recombinantes sans origine animale par flacon à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. À la fin de l’incubation, inclinez doucement chaque flacon d’avant en arrière à quelques reprises pour détacher les cellules avant de neutraliser l’enzyme avec cinq millilitres de PBS par culture.
Mettre en commun les cellules dissociées dans un seul tube de centrifugeuse de 50 millilitres et utiliser une pipette pour décomposer les touffes cellulaires. Après le comptage, recueillir les cellules par centrifugation. Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules à une fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre dans PBS frais.
Congelez ensuite les cellules dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant au moins deux heures jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement congelé avant de placer la solution cellulaire congelée dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit complètement décongelée. Pour évaluer les effets d’une couche de protéine adsorbée sur l’activité NF-kappa-B/AP-1 à base de récepteurs toll-like, après avoir augmenté les macrophages des journalistes dans un flacon de taille appropriée à 70 % de confluence, détachez les cellules avec une solution de dissociation enzymatique appropriée, comme démontré. Resuspendez les cellules à 7,3 fois 10 à la concentration de cinq cellules par millilitre dans le milieu d’essai, et aliquot les cellules uniformément entre trois tubes.
Traiter le premier tube des cellules avec un microgramme par millilitre d’inhibiteur du TLR4 pendant 60 minutes à température ambiante, traiter le deuxième tube avec 50 microgrammes par millilitre d’anticorps anti-TLR2 pendant 30 minutes à température ambiante, et laisser le troisième tube à température ambiante sans traitement. Pendant que les cellules couvent, ajouter 200 microlitres de lysate et 10% de sérum bovin fœtal à trois puits collants par condition. Laissez les protéines s’adsorb à 37 degrés Celsius pour la période expérimentale appropriée avant d’aspirer les solutions protéiques avec une nouvelle pipette Pasteur pour chaque puits et de laver les surfaces collantes du puits trois fois avec 250 microlitres de PBS par puits pendant cinq minutes par lavage.
À la fin du traitement macrophage reporter, ajouter 200 microlitres de solution cellulaire à chaque puits. Ajouter Pam3CSK4 à une concentration finale de 150 nanogrammes par millilitre à deux puits comme un contrôle positif TLR2 comme illustré dans le schéma. Pour un contrôle positif TLR4, ajouter la lipopolysaccharide à une concentration finale de 1,5 microgramme par millilitre à deux puits.
Après 20 heures à 37 degrés Celsius, plaque 20 microlitres de supernatant de chaque puits en double dans une plaque de 96 puits, y compris trois puits avec 20 microlitres de milieu d’essai par ainsi que le contrôle de fond. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de réaccès reporter SEAP à chaque puits, et couvrez la plaque avec un joint adhésif pour une incubation de 2 1/2 heures à 37 degrés Celsius. Transférer le reste du supernatant dans un tube de 1,5 millilitre par puits collant et sédimenter les débris par centrifugation.
Transférez ensuite les supernatants dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre pour un stockage de moins 80 degrés Celsius pour l’analyse pro-inflammatoire en aval de la cytokine par ELISA. À la fin de l’incubation, retirer le joint adhésif de la plaque et lire l’absorption sur un lecteur plaqueur à 635 nanomètres. Le trempage des glissières de microscope enduites de PMMA dans 70 % d’éthanol pendant une heure élimine le revêtement PMMA, tandis que ni l’éthanol à 70 % ni la stérilisation UV n’influencent l’angle de contact de l’eau des couvre-clés recouverts de fPTFE.
L’analyse occidentale des taches de lysates 3T3 révèle la présence de HMGB1 et de protéine de choc thermique 60, deux modèles moléculaires associés aux dommages bien documentés. L’adsorption des ligands TLR à partir du lysate sur les surfaces polymères peut être confirmée par la culture des macrophages reporter pendant 20 heures sur les surfaces polymères protéiques adsorbed, puis indirectement l’évaluation de l’activité NF-kappa-B/AP-1 via un essai enzymatique. Cette activité est réduite suite à l’inhibition de la signalisation TLR2 ou TLR4.
En outre, les macrophages de journaliste ont sensiblement augmenté l’activité de NF-kappa-B/AP-1 en réponse au lysate adsorbed comparé au FBS adsorbed ou au plasma et aucune protéine pré-adsorbed. En outre, de petites quantités de lysate diluées dans le sérum induisent des réponses significativement accrues de NF-kappa-B/AP-1 comparées au sérum seul, avec la dilution efficace la plus basse dépendante de la surface de polymère. Pour éviter la contamination en endotoxine des surfaces enduites, travaillez dans des endroits propres, couvrez les surfaces lorsqu’elles ne sont pas utilisées et utilisez de l’eau et des tampons de qualité de culture cellulaire pour les rinçages.
Après cette procédure, des immunoassays peuvent être exécutés sur les supernatants restants pour évaluer la sécrétion de protéine, et les macrophages peuvent être analysés par cytométrie de flux et analyse d’expression de gène de qPCR.
