Este protocolo permite a rápida avaliação da atividade NF-kappa-B e AP-1 em macrófagos repórteres cultivados em camadas de proteína adsorvidas e a contribuição de vias de sinalização celular, como receptores semelhantes a pedágio, para essa resposta. A principal vantagem desta técnica é sua simplicidade, permitindo que os supernacantes da cultura celular sejam rapidamente analisados para a atividade NF-kappa-B e AP-1 usando um ensaio enzimático simples. Comece dissolvendo PMMA em clorofórmio a 20 miligramas por mililitro concentração final em um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros em um capô de fumaça.
Coloque uma barra de mexida magnética no frasco e mexa a mistura por pelo menos duas horas. Quando todos os sólidos tiverem sido dissolvidos, transfira 400 microlitros da solução PMMA para o centro de cada deslizamento de microscópio de vidro borossilicato por condição planejada em um revestimento de giro, e gire o PMMA para o slide por dois minutos a 3.000 rotações por minuto. Em seguida, armazene os slides revestidos de spin em uma caixa limpa pulverizada com etanol de 70%.
Em seguida, em um gabinete de segurança biológica, use fórceps estéreis e técnica asséptica para anexar poços pegajosos de oito câmaras aos slides revestidos pmma, pressionando firmemente na parte superior de cada poço pegajoso para se certificar de que eles estão fortemente ligados. Tome cuidado para alinhar os poços pegajosos com as bordas do slide do microscópio para que todos os poços se conectem ao slide e não vazem. Incubar os slides bem anexados a 37 graus Celsius durante a noite para fixar as vedações.
Em seguida, adicione 200 microliters de cultura celular grau água livre de endotoxinas para cada poço para uma incubação de 60 minutos à temperatura ambiente para testar as focas na manhã seguinte. No final da incubação, aspire a água, tomando cuidado para não perturbar o revestimento pmma. Lave cada poço três vezes com 300 microliters de água fresca sem endotoxina por uma hora por lavagem, seguido de uma lavagem de 12 horas e uma de 24 horas antes de usar para remover qualquer solvente restante.
Em seguida, UV esterilizar os slides por 30 minutos. Para obter 3T3 células lísatos, quando as culturas celulares 3T3 atingem 70% de confluência em frascos de cultura T150, lave cada cultura com cinco mililitros de PBS, e trate as células com cinco mililitros de enzima de dissociação celular recombinante livre de origem animal por frasco de frasco a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. No final da incubação, incline suavemente cada frasco para frente e para trás algumas vezes para desprender as células antes de neutralizar a enzima com cinco mililitros de PBS por cultura.
Acumule as células dissociadas em um único tubo de centrífuga de 50 mililitros, e use uma pipeta para quebrar qualquer aglomerado de células. Após a contagem, colete as células por centrifugação. Aspire o supernasce, e resuspenda as células em uma vezes 10 para as seis células por concentração mililitro em PBS fresco.
Em seguida, congele as células em um congelador Celsius de menos 80 graus por pelo menos duas horas até que a amostra esteja totalmente congelada antes de colocar a solução celular congelada em um banho de água Celsius de 37 graus até descongelar completamente. Para avaliar os efeitos de uma camada de proteína adsorvida na atividade NF-kappa-B/AP-1 mediada pelo receptor toll, depois de cultivar macrófagos repórteres em um frasco de tamanho apropriado para 70% de confluência, desprende as células com uma solução de dissociação enzimática apropriada, como demonstrado. Resuspenque as células a 7,3 vezes 10 às cinco células por concentração mililitro no meio de ensaio, e aliquot as células uniformemente entre três tubos.
Trate o primeiro tubo de células com um micrograma por mililitro do inibidor TLR4 por 60 minutos à temperatura ambiente, trate o segundo tubo com 50 microgramas por mililitro de anticorpo anti-TLR2 por 30 minutos à temperatura ambiente e deixe o terceiro tubo em temperatura ambiente sem tratamento. Enquanto as células estão incubando, adicione 200 microliters de liseto e 10% soro bovino fetal a três poços pegajosos por condição. Permita que as proteínas adsorb a 37 graus Celsius para o período experimental apropriado antes de aspirar as soluções proteicas com uma nova pipeta Pasteur para cada poço e lavar as superfícies do poço pegajoso três vezes com 250 microliters de PBS por poço por cinco minutos por lavagem.
No final do tratamento do macrófago repórter, adicione 200 microliters de solução celular a cada poço. Adicione Pam3CSK4 a uma concentração final de 150 nanogramas por mililitro a dois poços, como um controle positivo TLR2, conforme ilustrado no esquema. Para um controle positivo TLR4, adicione lipopólise a uma concentração final de 1,5 microgramas por mililitro a dois poços.
Após 20 horas a 37 graus Celsius, placa 20 microlitres de supernascer de cada poço em duplicação em uma placa de 96 poços, incluindo três poços com 20 microliters de médio ensaio por bem como o controle de fundo. Em seguida, adicione 200 microliters de reagente de ensaio de repórter SEAP a cada poço, e cubra a placa com um selo adesivo para uma incubação de 2 horas e meia a 37 graus Celsius. Transfira o restante do supernasal para um tubo de 1,5 mililitro por poço pegajoso, e sedimente os detritos por centrifugação.
Em seguida, transfira os supernantes para novos tubos de 1,5 mililitro para menos 80 graus Celsius de armazenamento para análise de citocinas proinflamatórias a jusante pela ELISA. No final da incubação, remova o selo adesivo da placa e leia a absorvância em um leitor de chapas a 635 nanômetros. A imersão de slides de microscópio revestido de PMMA em 70% de etanol durante uma hora remove o revestimento pmma, enquanto nem a esterilização de 70% de etanol nem uv influencia o ângulo de contato com a água das tampas revestidas da FPTFE.
A análise de manchas ocidentais de 3T3 lysates revela a presença tanto de HMGB1 quanto de proteína de choque térmico 60, dois padrões moleculares bem documentados associados a danos. A adsorção de ligantes TLR do lisato para as superfícies do polímero pode ser confirmada por macrófagos repórteres por 20 horas nas superfícies de polímeros adsorvidas por proteínas e, em seguida, avaliando indiretamente a atividade NF-kappa-B/AP-1 através de um ensaio enzimático. Esta atividade é reduzida após a inibição da sinalização TLR2 ou TLR4.
Além disso, os macrófagos repórteres aumentaram significativamente a atividade NF-kappa-B/AP-1 em resposta ao teor de adsorvida em comparação com fbs adsorvida ou plasma e nenhuma proteína pré-adsorvida. Além disso, pequenas quantidades de diluído em soro induzem significativamente respostas NF-kappa-B/AP-1 em comparação apenas com soro, com a menor diluição efetiva dependente da superfície do polímero. Para evitar a contaminação da endotoxina das superfícies revestidas, trabalhe em áreas limpas, cubra as superfícies quando não estiver em uso e use água de grau de cultura celular e tampões para enxagua.
Após este procedimento, os imunoensatórios podem ser realizados nos demais supernacantes para avaliar a secreção proteica, e os macrófagos podem ser analisados por citometria de fluxo e análise de expressão genética qPCR.
