Birçok nörolojik bozukluklarda nörodenegration nöronal lif kaybı genellikle hücre vücut kaybı öncesinde oluşur kronik bir süreçtir. Nöronal liflerin üç boyutlu stereoolojik niceliği, erken nörodejeneratif değişimi saptaması için hassas ve doğru bir yöntem sağlar. Bu teknoloji, 3D nöronal lifler gibi çizgi benzeri yapıların uzunluklarını ölçmek için uzay toplarının güvenilir ve verimli bilgisayar tabanlı tarafsız fraksiyonu kullanır.
Prosedürü gösteren Prabhakar Singh, bir post-doc ve stereology uzmanı ve David Peng, benim laboratuvarda araştırma asistanı tarafından yapılacaktır. Anestezili farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, transkardial perfuse buz soğuk yaklaşık 50 mililitre 0.1 molar DPBS, 0.1 molar PBS içinde yaklaşık 25 mililitre 4% PFA takip. Perfüzyonsonunda, dört santigrat derece 24 saat boyunca taze% 4 PFA bir kapta beyin post-fix.
Ertesi gün, yıkama başına taze DPBS üç bir ila iki dakikalık yıkar ile beyin yıkayın ve 0.1 DPBS çözüm gecede% 15 sakaroz içine beyin transfer. Ertesi sabah, beyni %30 sakaroz solüsyonuna ve 48 saat boyunca 48 saat boyunca 0.1 azı dpbs'e yerleştirin. Kuluçka nın sonunda, beyni eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyotom odasına aktarın.
Beyinler kapalı tüplerde tutulabilir ve eksi 80 derecede saklanabilir. Kesitleme için doku örneğini optimum kesme sıcaklığına yerleştirin ve numuneyi bir numune diskine yerleştirin. Daha sonra kriyotomda koronal düzlemde seri 30 mikrometre kalınlığında kesitler elde ederek, her bir bölümü eksi 20 santigrat derece depolamaya hazırlanırken kriyoprotektif solüsyon içeren 24 kuyulu bir kültür plakasının ayrı kuyularına aktarın.
Her beynin ilk ve son bölümlerini tanımlamak için, standart bir fare beyin atlası ile morfolojik özellikleri karşılaştırın. NBM bregma eksi 0.0 milimetre başlar ve eksi 1.6 milimetre biter. Her sekizinci bölümün seçimi toplam altı ila yedi bölüm verir ve hem hacim hem de lif uzunluğu tahmini için uygun bir hata katsayısı sağlar.
Doku bölümlerinin immünohistokimyasal etiketlemeiçin, Tris-tamponlu tuzlu 0,1% Triton X-100% 10 normal sığır serumile herhangi bir nonspesifik bağlama bloke sonra, dört santigrat derece 48 saat ilgi birincil antikor ile bölümleri etiket. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir biyotinylated ikincil antikor ile kuluçka takip, yıkama başına taze Tris tamponlu tuzlu üç dakika boyunca üç kez bölümleri yıkayın. Kuluçka sonunda, taze Tris-tamponlu salin üç kez yıkama, üreticinin protokollerine göre Avidin biotin peroksidaz kompleksi ve DAB peroksidaz substrat çözeltisi ile boyama izledi.
Yıkadıktan sonra, bir beyin dokusu örneğinden tüm bölümleri jelatinize bir slaytüzerine monte edin ve örneklerin kurumasını bekleyin. Bölümleri susuzleştirmek için, numuneleri seyreltme başına beş dakika boyunca iki kez sıralı artan etanol çözeltilerinde, ardından iki adet 10 dakikalık ksilen yıkar ile temizleyin. Daha sonra, kapakları slaytların üzerine yerleştirmek için uygun bir montaj ortamı kullanın.
Stereoloji için, yazılım yeni bir çalışma açın. Bir çalışma başlatma diyalog kutusu açılacaktır. Çalışma bilgilerini doldurun ve çok düzeyli kesir tabanlı seçili olduğunu doğrulayın.
Birim diyalog kutusunu açmak için ses düzeyine çift tıklayın. İlgi çekici özelliği ni belirleyin ve bölge nokta sayma sondasını seçin ve sonrakini tıklatın. Uzunluğa çift tıklayın ve özelliğin adını sağlayın.
Küre sondası seçin ve sonrakini tıklatın. Vaka başlatma kutusunda, çalışmaya başlamadan önce grupları kodlamak için, ilgi alanını içeren ilk bölümden başlayarak toplam bölüm sayısını ilgi alanını içeren son bölüme ve bölüm örnekleme aralığını sekize ayarlayın. Bölge seçimi ve hacim tahmini için en düşük büyütmeyi otomatik olarak ayarlayacak ve ayarları onaylayacak sonda başlatma diyalog kutusunu açmak için hemen tıklayın.
Seçilen alt büyütmede ilgi alanının tanımlanıp tanımlanamamasını kontrol etmek için önizlemeyi tıklatın. Bölge hacmi fraksiyonu için nokta başına 50,000 mikrometre küp girin ve önizleme ve bitti'yi tıklatın. Nesne yüksek büyütme altında, uzunluğu 63X ve çift tıklatma uzunluğu uzunluk küre diyalog kutusunu açmak için ayarlayın.
Bu kürenin çapını 10 mikrometreye ayarlayın ve tıklayın. Çerçeve alanı, çerçeve yüksekliği, koruma bölgesi ve çerçeve aralığı için uygun değerleri ayarlayın. Sonra sonraki tıklatın ve yazılım tarafından sağlanan yönergeleri izleyin.
İlk bölümü eklemek için, slaytı 5X hedefi altında mikroskop aşamasına yerleştirin ve ilgi bölgesini tanımlamak için NBM'nin etrafında rasgele bir sınır çizmek için yeşil oku tıklatın. Yeşil ok tıklayın ve geçerli kesir lif ölçümleri elde etmek için 63X hedefi değiştirmek için yapılır. Kesit kalınlığı diyalog kutusu görüntülenir.
Manuel z ekseni odak düğmesini kullanarak bölümün gerçek kalınlığını ölçmek için bölümün üst ve alt yüzeyini ayarlayın ve bitti'yi tıklatın. Sanal küre sondasının yüzeyindekesişen tüm lifleri işaretlemek için bölümün çerçeve yüksekliğinde z eksenini yavaşça yukarıdan aşağıya doğru hareket ettirin. Tüm lifler işaretlendiğinde, bir sonraki konuma ilerlemek için hemen tıklatın.
Tüm kesirler tamamlandığında, yeşil oku tıklatın. Yazılım sonraki bölümün eklenmesini isteyecektir. Slayttaki bir sonraki örneği 5X hedefini kullanarak odak haline getirin ve lif ölçümlerini az önce gösterildiği gibi tekrarlayın.
Tüm bölümler ölçüldüğünde, yazılım hata değerlerinin katsayısını gösteren durum için bir sonuç oluşturur. Hata katsayısı kabul edilebilirse, bir sonraki servis talebine devam edin. Hata katsayısı kabul edilemezse, yazılım bazı parametreleri değiştirmek için öneriler sağlar.
Tüm servis talepleri tamamlandığında, her servis talebi ve grup için sonuç oluşturun. Bu temsili deneyde, İsveç mutant beta amiloid öncüprotein grubu yabani tip çöp eşleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük lif uzunluğu ve lif uzunluğu yoğunluğu gösterdi. Sonuçlar ayrıca analiz edilen iki grup arasında NBM hacminde anlamlı bir fark olmadığını gösterdi.
Bu teknik, doğru oryantasyonda doğru edinimi ve kuluçka dönemi ile iyi bir boyama yöntemi gerektirir. Stereoloji protokolü diğer nöronal lifler, astrosit süreçleri, hatta vasküler profiller gibi herhangi bir doğrusal profillerin tahmini için kullanılabilir.
