Neurodenegration bei vielen neurologischen Erkrankungen ist ein chronischer Prozess, von dem neuronale Faserverlust oft vor dem Zellkörperverlust auftritt. Die stereologische Quantifizierung neuronaler Fasern in drei Dimensionen bietet eine empfindliche und genaue Methode zur Erkennung früher neurodegenerativer Veränderungen. Diese Technologie nutzt die zuverlässige und effiziente computerbasierte unvoreingenommene Fraktionierung von Raumkugeln, um die Längen von linienähnlichen Strukturen wie neuronalen Fasern in 3D zu messen.
Die Demonstration des Verfahrens wird von Prabhakar Singh, einem Post-Doc und unserem Experten für Stereologie, und David Peng, dem wissenschaftlichen Assistenten in meinem Labor, durchgeführt. Nach Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Pedalreflex in der anästhesierten Maus, transkardial perfuse mit etwa 50 Milliliter eiskalten 0,1 Molar DPBS, gefolgt von etwa 25 Milliliter von 4%PFA in 0,1 Molaren PBS. Am Ende der Perfusion, post-fix das Gehirn in einem Behälter von frischen 4%PFA für 24 Stunden bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Tag waschen Sie das Gehirn mit drei ein- bis zweiminütigen Waschungen in frischem DPBS pro Waschgang und übertragen Sie das Gehirn über Nacht in eine 15%Saccharose in 0,1 DPBS-Lösung. Am nächsten Morgen, legen Sie das Gehirn in eine 30%Saccharose-Lösung und 0,1 Molaren DPBS für 48 Stunden bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, übertragen Sie das Gehirn in eine Kryotome Kammer voreingestellt auf minus 20 Grad Celsius.
Gehirne können in versiegelten Röhren aufbewahrt und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Zum Schneiden die Gewebeprobe in ein optimales Schnitttemperatur-Einbettmedium einbetten und die Probe auf einer Probenscheibe montieren. Dann erwerben serielle 30 Mikrometer dicke Abschnitte in einer koronalen Ebene in der Kryotome, übertragung enzieren jeden Abschnitt in einzelne Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte mit Kryoprotektor-Lösung in Vorbereitung auf minus 20 Grad Celsius Lagerung.
Um den ersten und letzten Abschnitt jedes Gehirns zu identifizieren, vergleichen Sie die morphologischen Merkmale mit einem Standard-Maus-Gehirnatlas. NBM beginnt bei Bregma minus 0,0 Millimetern und endet bei minus 1,6 Millimetern. Die Auswahl jedes achten Abschnitts ergibt insgesamt sechs bis sieben Abschnitte und ermöglicht einen geeigneten Fehlerkoeffizienten für eine Volumen- und Faserlängenschätzung.
Für die immunhistochemische Etikettierung der Gewebeabschnitte, nach der Blockierung jeder unspezifischen Bindung mit 10%normalem Rinderserum in 0,1%Triton X-100 in Tris-gepufferter Salin, beschriften Sie die Abschnitte mit dem primären Antikörper von Interesse für 48 Stunden bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Abschnitte dreimal drei Minuten in frischer Tris-gepufferter Kochchen pro Wäsche waschen, gefolgt von einer Inkubation mit einem geeigneten biotinylierten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Abschnitte am Ende der Inkubation dreimal in frischer Tris-gepufferter Kochsaline, gefolgt von der Färbung mit Deminzin-Peroxidase-Komplex und dAB-Peroxidase-Substratlösung nach den Protokollen des Herstellers.
Nach dem Waschen alle Abschnitte aus einer Hirngewebeprobe auf einen gelatinierten Schlitten montieren und die Proben trocknen lassen. Um die Abschnitte zu dehydrieren, tauchen Sie die Proben zweimal für fünf Minuten pro Verdünnung in sequenzielle aufsteigende Ethanollösungen ein, wie angegeben, gefolgt von der Reinigung mit zwei 10-minütigen Xylol-Waschen. Verwenden Sie dann ein geeignetes Montagemedium, um Abdeckungen auf die Dias zu legen.
Für die Stereologie, öffnen Sie eine neue Studie in der Software. Eine Dialogbox für die Studieninitialisierung wird geöffnet. Füllen Sie die Studieninformationen aus, und bestätigen Sie, dass mehrstufige Fraktionsbasierte ausgewählt ist.
Doppelklicken Sie auf Lautstärke, um das Lautstärkedialogfeld zu öffnen. Benennen Sie das von Interesse ist, und wählen Sie den Punktzählungspunkt der Region aus, und klicken Sie auf Weiter. Doppelklicken Sie auf die Länge und geben Sie einen Namen der Funktion an.
Wählen Sie den Kugelsondenpunkt aus, und klicken Sie auf Weiter. Um die Gruppen vor Beginn der Studie zu codieren, legen Sie im Feld "Initialisierung" die Gesamtzahl der Abschnitte fest, die vom ersten Abschnitt mit dem Interessenbereich bis zum letzten Abschnitt mit dem Interessenbereich und dem Abschnittsstichprobenintervall beginnen, auf acht. Klicken Sie auf neben, um das Dialogfeld für die Testinitialisierung zu öffnen, in dem automatisch die niedrigste Vergrößerung für die Regionsauswahl und die Volumenschätzung festgelegt wird, und die Einstellungen bestätigen.
Klicken Sie auf Vorschau, um zu überprüfen, ob der Interessenbereich bei der ausgewählten unteren Vergrößerung identifiziert werden kann. Geben Sie 50.000 Mikrometer Würfel pro Punkt für den Regionsvolumenanteil ein, und klicken Sie auf Vorschau und Fertig. Legen Sie unter Objekt-Hochvergrößerung die Länge auf 63X fest, und doppelklicken Sie auf die Länge, um das Dialogfeld Länge der Kugel zu öffnen.
Stellen Sie den Durchmesser dieser Kugel auf 10 Mikrometer und klicken Sie auf Fertig. Legen Sie die entsprechenden Werte für den Rahmenbereich, die Rahmenhöhe, die Schutzzone und den Rahmenabstand fest. Klicken Sie dann auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen der Software.
Um den ersten Abschnitt einzufügen, platzieren Sie die Folie auf der Bühne des Mikroskops unter einem 5-Fach-Objektiv und klicken Sie auf den grünen Pfeil, um eine beliebige Grenze um die NBM zu ziehen, um den Interessenbereich zu definieren. Klicken Sie auf den grünen Pfeil und tun Sie, um das 63X-Ziel zu ändern, um die Fasermessungen des aktuellen Bruchs zu erhalten. Die Dialogbox für die Schnittdicke wird angezeigt.
Legen Sie die obere und untere Oberfläche des Abschnitts fest, um die tatsächliche Dicke des Abschnitts mit dem manuellen Fokusknopf für die Z-Achse zu messen, und klicken Sie darauf, fertig zu sein. Verschieben Sie die Z-Achse langsam von oben nach unten in der Rahmenhöhe des Abschnitts, um alle sich schneidenden Fasern auf der Oberfläche der virtuellen Kugelsonde zu markieren. Wenn alle Fasern markiert sind, klicken Sie auf weiter, um zum nächsten Speicherort zu fahren.
Wenn alle Brüche abgeschlossen sind, klicken Sie auf den grünen Pfeil. Die Software wird darum bitten, den nächsten Abschnitt eingefügt zu haben. Bringen Sie die nächste Probe auf dem Dia mit dem 5X-Objektiv in den Fokus und wiederholen Sie die Fasermessung, wie gerade gezeigt.
Wenn alle Abschnitte gemessen wurden, generiert die Software ein Ergebnis für den Fall, das den Koeffizienten der Fehlerwerte anzeigt. Wenn der Fehlerkoeffizient akzeptabel ist, fahren Sie mit dem nächsten Fall fort. Wenn der Fehlerkoeffizient nicht akzeptabel ist, gibt die Software Empfehlungen, um einige der Parameter zu ändern.
Wenn alle Anfragen abgeschlossen sind, generieren Sie Ergebnisse für jeden Fall und jede Gruppe. In diesem repräsentativen Experiment zeigte die schwedische Mutante Beta-Amyloid-Vorläuferproteingruppe eine deutlich geringere Faserlänge und Faserlängendichte im Vergleich zu ihren Wild-Wurf-Kollegen. Die Ergebnisse zeigten auch, dass es keinen signifikanten Unterschied im Volumen der NBM zwischen den beiden analysierten Gruppen gab.
Diese Technik erfordert die richtige Erfassung in der richtigen Ausrichtung und eine gute Färbemethode mit der Inkubationszeit. Das stereologische Protokoll kann für die Schätzung von linearen Profilen wie anderen neuronalen Fasern, Astrozytenprozessen oder sogar Gefäßprofilen verwendet werden.
