La neurodengration dans de nombreux troubles neurologiques est un processus chronique dont la perte de fibres neuronales se produit souvent avant la perte du corps cellulaire. La quantification stéréologique des fibres neuronales en trois dimensions fournit une méthode sensible et précise pour détecter les changements neurodégénératifs précoces. Cette technologie utilise la fractionnement impartial fiable et efficace par ordinateur des boules d’espace pour mesurer les longueurs des structures en forme de ligne telles que les fibres neuronales en 3D.
La démonstration de la procédure sera effectuée par Prabhakar Singh, un post-doc et notre expert en stéréologie, et David Peng, l’assistant de recherche dans mon laboratoire. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez la souris anesthésiée, transcardially perfuser avec environ 50 millilitres de glace froide 0,1 molaire DPBS, suivie d’environ 25 millilitres de 4%PFA dans 0,1 molaire PBS. À la fin de la perfusion, post-fixer le cerveau dans un récipient de frais 4%PFA pendant 24 heures à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, lavez le cerveau avec trois lavages d’une à deux minutes dans le DPBS frais par lavage et transférez le cerveau dans un saccharose de 15% dans la solution 0.1 DPBS pendant la nuit. Le lendemain matin, placez le cerveau dans une solution de saccharose de 30% et 0,1 DPBS molaire pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, transférer le cerveau dans une chambre cryotome préédée à moins 20 degrés Celsius.
Les cerveaux peuvent être conservés dans des tubes scellés et stockés à moins 80 degrés Celsius. Pour le sectioning, intégriez l’échantillon de tissu dans le milieu optimal d’intégration de température de coupe et montez l’échantillon sur un disque d’échantillon. Ensuite, acquérir des sections épaisses de 30 micromètres en série dans un plan coronal dans le cryotome, en transférant chaque section dans des puits individuels d’une plaque de culture de 24 puits contenant une solution cryoprotectrice en préparation d’un stockage de moins 20 degrés Celsius.
Pour identifier les première et dernière sections de chaque cerveau, comparez les caractéristiques morphologiques avec un atlas standard du cerveau de la souris. NBM commence à bregma moins 0,0 millimètres et se termine à moins 1,6 millimètres. La sélection de chaque huitième section donne un total de six à sept sections et permet un coefficient d’erreur approprié pour une estimation du volume et de la longueur de la fibre.
Pour l’étiquetage immunohistochimique des sections tissulaires, après avoir bloqué toute liaison non spécifique avec le sérum bovin 10% normal dans 0,1%Triton X-100 dans la solution saline tamponnée par Tris, étiquetez les sections avec l’anticorps primaire d’intérêt pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les sections trois fois pendant trois minutes dans une solution saline fraîche tamponnée par lavage, suivie de l’incubation avec un anticorps secondaire biotinylé approprié pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les sections trois fois dans une solution saline fraîche tamponnée par Tris, comme démontré, suivie d’une coloration avec le complexe de peroxydse de biotine Avidin et la solution de substrat de peroxyde DAB selon les protocoles du fabricant.
Après le lavage, monter toutes les sections à partir d’un échantillon de tissu cérébral sur une lame gélatincisée et laisser sécher l’air des échantillons. Pour déshydrater les sections, immerger les échantillons deux fois pendant cinq minutes par dilution dans des solutions d’éthanol ascendantes séquentielles comme indiqué, puis déblayer avec deux lavages de xylène de 10 minutes. Utilisez ensuite un support de montage approprié pour placer des coverslips sur les toboggans.
Pour la stéréologie, ouvrez une nouvelle étude dans le logiciel. Une boîte de dialogue d’initialisation d’étude s’ouvrira. Remplissez l’information de l’étude et confirmez que la fraction à plusieurs niveaux est sélectionnée.
Double-cliquez sur le volume pour ouvrir la boîte de dialogue de volume. Nommez la fonctionnalité d’intérêt et sélectionnez la sonde de comptage des points de la région et cliquez ensuite. Double-cliquez sur la longueur et de fournir un nom de la fonctionnalité.
Sélectionnez la sonde de sphère et cliquez ensuite. Dans la case initialisation, pour coder les groupes avant de commencer l’étude, fixez le nombre total de sections à partir de la première section contenant la zone d’intérêt à la dernière section contenant la zone d’intérêt et l’intervalle d’échantillonnage de la section à huit. Cliquez à côté pour ouvrir la boîte de dialogue d’initialisation de la sonde qui définira automatiquement le grossissement le plus bas pour la sélection de la région et l’estimation du volume et confirmera les paramètres.
Cliquez sur aperçu pour vérifier si la région d’intérêt peut être identifiée lors du grossissement inférieur sélectionné. Entrez 50 000 micromètres cube par point pour la fraction de volume de la région et cliquez sur aperçu et fait. Sous le grossissement élevé de l’objet, réglez la longueur à 63X et double-cliquez sur la longueur pour ouvrir la boîte de dialogue de sphère de longueur.
Réglez le diamètre de cette sphère à 10 micromètres et cliquez dessus. Définissez les valeurs appropriées pour la zone du cadre, la hauteur du cadre, la zone de garde et l’espacement du cadre. Cliquez ensuite et suivez les instructions fournies par le logiciel.
Pour insérer la première section, placez la diapositive sur la scène du microscope sous un objectif 5X et cliquez sur la flèche verte pour tracer une limite arbitraire autour de la NBM pour définir la région d’intérêt. Cliquez sur la flèche verte et fait pour changer l’objectif 63X pour obtenir les mesures de fibre de la fraction actuelle. La boîte de dialogue d’épaisseur de section apparaîtra.
Réglez la surface supérieure et inférieure de la section pour mesurer l’épaisseur réelle de la section à l’aide du bouton de mise au point manuel z-axe et cliquez sur fait. Déplacez lentement l’axe z de haut en bas dans la hauteur du cadre de la section pour marquer toutes les fibres qui se croisent à la surface de la sonde de sphère virtuelle. Lorsque toutes les fibres ont été marquées, cliquez à côté pour passer à l’emplacement suivant.
Lorsque toutes les fractions ont été complétées, cliquez sur la flèche verte. Le logiciel demandera l’insérer dans la section suivante. Mettre l’échantillon suivant sur la diapositive au point en utilisant l’objectif 5X et répéter la mesure de la fibre comme vient de le démontrer.
Lorsque toutes les sections ont été mesurées, le logiciel générera un résultat pour le cas montrant le coefficient de valeurs d’erreur. Si le coefficient d’erreur est acceptable, passez au cas suivant. Si le coefficient d’erreur n’est pas acceptable, le logiciel fournira des recommandations pour modifier certains paramètres.
Lorsque tous les cas ont été terminés, générer des résultats pour chaque cas et groupe. Dans cette expérience représentative, le groupe suédois mutant de protéine précurseur bêta-amyloïde a démontré une longueur significativement inférieure de fibre et densité de longueur de fibre comparée à leurs compagnons de litière sauvages-type. Les résultats ont également montré qu’il n’y avait pas de différence significative dans le volume de la NBM entre les deux groupes analysés.
Cette technique nécessite une bonne acquisition dans la bonne orientation et une bonne méthode de coloration avec la période d’incubation. Le protocole stéréologie peut être utilisé pour l’estimation de tous les profils linéaires tels que d’autres fibres neuronales, processus des astrocytes, ou même des profils vasculaires.
