많은 신경 장애에서 신경 절개는 신경 섬유 손실이 종종 세포 체손실 이전에 발생하는 만성 과정입니다. 3차원의 뉴런 섬유의 입체적 정량화는 조기 신경 퇴행성 변화를 검출하는 민감하고 정확한 방법을 제공합니다. 이 기술은 공간 공의 안정적이고 효율적인 컴퓨터 기반의 편견분획을 활용하여 3D의 뉴런 섬유와 같은 라인과 같은 구조의 길이를 측정합니다.
절차를 시연하는 것은 포스트 닥터이자 스테레오로지 전문가인 Prabhakar Singh와 제 실험실의 연구 조교인 데이비드 펭(David Peng)이 할 것입니다. 마취 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 약 50 밀리리터의 얼음 차가운 0.1 어금니 DPBS와 트랜스 카디에 퍼퓨즈, 0.1 어금니 PBS에서 4 %의 PFA의 약 25 밀리리터가 그 뒤를 이었다. 관류의 끝에서, 4섭씨에서 24 시간 동안 신선한 4 % PFA의 용기에 뇌를 수정합니다.
다음 날, 세척 당 신선한 DPBS에 3 1 ~ 2 분 세척으로 뇌를 세척하고 하룻밤 0.1 DPBS 솔루션에서 15 %의 자당으로 뇌를 전송합니다. 다음 아침, 뇌를 섭씨 30%, 어금니 DPBS 0.1을 섭씨 48시간 동안 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 뇌를 영하 20도까지 미리 설정된 극저온 챔버로 옮는다.
뇌는 밀봉 된 튜브에 보관하고 영하 80도에서 보관 할 수 있습니다. 단면의 경우, 조직 샘플을 최적의 절삭 온도에 포함시키는 매체에 포함시키고 시편 디스크에 샘플을 장착한다. 그런 다음 극저온 평면의 관상 에서 직렬 30 마이크로 미터 두께의 섹션을 획득하여 각 섹션을 영하 20도 저장을 준비하기 위해 극저온 보호용 액트를 포함하는 24 웰 배양 판의 개별 우물로 옮기.
각 뇌의 첫 번째 및 마지막 섹션을 식별하려면 형태학적 특징을 표준 마우스 뇌 아틀라스와 비교하십시오. NBM은 0.0 밀리미터를 뺀 브레그마에서 시작하여 영하 1.6밀리미터로 끝납니다. 모든 8분의 1의 섹션은 총 6~7개의 섹션을 생성하며 부피 및 섬유 길이 추정모두에 적절한 오류 계수를 허용합니다.
조직 섹션의 면역조직화학적 라벨링의 경우, Tris 완충식식염수에서 0.1%트리톤 X-100의 정상 소 혈청이 10%로 임의의 비특이적 결합을 차단한 후, 48섭씨에서 48시간 동안 1차 적시 항체로 단면을 라벨링한다. 인큐베이션이 끝나면 세척당 신선한 트리버퍼식염수로 3분간 3분간 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 적절한 생체 개화 된 이차 항체를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 설명대로 신선한 트리버퍼식 식염수로 섹션을 세 번 세척하고, 제조 업체의 프로토콜에 따라 아비딘 비오틴 과옥시다제 복합체 및 DAB peroxidase 기판 용액으로 염색하는 다음.
세척 후, 하나의 뇌 조직 샘플에서 모든 섹션을 하나의 젤라틴 슬라이드에 장착하고 샘플을 공기 건조시킬 수 있도록합니다. 단면을 탈수하려면 표시된 대로 순차적인 오름차순 에탄올 용액에 희석당 5분 동안 샘플을 두 번 담그고 10분 자일렌 세차2개로 치우게 합니다. 그런 다음 적절한 장착 매체를 사용하여 커버립을 슬라이드에 배치합니다.
입체학의 경우 소프트웨어에 대한 새로운 연구를 엽니 다. 스터디 초기화 대화 상자가 열립니다. 학습 정보를 작성하고 다단계 분획 기반이 선택되어 있는지 확인합니다.
볼륨을 두 번 클릭하여 볼륨 대화 상자를 엽니다. 관심 기능이름을 지정하고 지역 점 계산 프로브를 선택하고 다음을 클릭합니다. 길이를 두 번 클릭하고 피쳐 이름을 제공합니다.
구 프로브를 선택하고 다음을 클릭합니다. 이 경우 초기화 상자에서 스터디를 시작하기 전에 그룹을 코딩하려면 관심 영역을 포함하는 첫 번째 섹션에서 시작하여 관심 영역과 섹션 샘플링 간격을 포함하는 마지막 섹션으로 시작하여 총 섹션 수를 8개로 설정합니다. 다음을 클릭하여 지역 선택 및 볼륨 추정에 대한 가장 낮은 배율을 자동으로 설정하고 설정을 확인하는 프로브 초기화 대화 상자를 엽니다.
미리 보기를 클릭하여 선택한 하위 배율에서 관심 영역을 식별할 수 있는지 확인합니다. 지역 볼륨 분획에 대해 점당 50, 000 마이크로미터 큐브를 입력하고 미리 보기를 클릭하고 완료합니다. 개체 높은 배율하에서 길이를 63X로 설정하고 길이를 두 번 클릭하여 길이 구 대화 상자를 엽니다.
이 구의 직경을 10 마이크로미터로 설정하고 완료한 것을 클릭합니다. 프레임 영역, 프레임 높이, 가드 존 및 프레임 간격에 적합한 값을 설정합니다. 그런 다음 다음을 클릭하고 소프트웨어에서 제공하는 지침을 따릅니다.
첫 번째 섹션을 삽입하려면 슬라이드를 5X 목표 아래에 현미경 단계에 배치하고 녹색 화살표를 클릭하여 NBM 주위에 임의의 경계를 그려 관심 영역을 정의합니다. 녹색 화살표를 클릭하고 현재 분획의 섬유 측정을 얻기 위해 63X 목표를 변경합니다. 단면 두께 대화 상자가 나타납니다.
섹션의 위쪽 및 아래쪽 표면을 설정하여 수동 z축 포커스 노브를 사용하여 섹션의 실제 두께를 측정하고 완료된 클릭합니다. z축을 섹션의 프레임 높이에서 위에서 아래로 천천히 이동하여 가상 구 프로브의 표면에 교차하는 모든 섬유를 표시합니다. 모든 섬유가 표시되면 다음 위치로 진행하려면 옆을 클릭합니다.
모든 분수가 완료되면 녹색 화살표를 클릭합니다. 소프트웨어는 다음 섹션을 삽입하도록 요청합니다. 5X 목표를 사용하여 슬라이드에 다음 샘플을 초점으로 가져와 서 방금 설명한 대로 섬유 측정을 반복합니다.
모든 섹션을 측정하면 소프트웨어가 오류 값계수를 표시하는 경우에 대한 결과를 생성합니다. 오류 계수가 허용되는 경우 다음 서비스 케이스로 진행합니다. 오류 계수를 허용하지 않으면 소프트웨어는 일부 매개 변수를 변경하는 권장 사항을 제공합니다.
모든 사례가 완료되면 각 서비스 케이스 및 그룹에 대한 결과를 생성합니다. 본 대표적인 실험에서, 스웨덴 돌연변이 베타 아밀로이드 전구체 단백질 그룹은 야생형 쓰레기 메이트에 비해 섬유 길이와 섬유 길이 밀도가 현저히 낮았다. 결과는 또한 분석된 두 단 사이 NBM의 부피에 있는 유의한 다름이 없었다는 것을 보여주었습니다.
이 기술은 올바른 방향에서 적절한 획득과 인큐베이션 기간의 좋은 염색 방법이 필요합니다. 입체 프로토콜은 다른 뉴런 섬유, 성상세포 공정 또는 혈관 프로파일과 같은 임의의 선형 프로파일의 추정에 사용될 수 있다.
