SNX-BAは、ヒト疾患において重要な役割を果たす膜改質タンパク質です。我々の方法を用いて、脂質結合および膜リモデリングを促進するために、その正確な生物物理学的性質を決定することができる。酵母細胞からSNB-BARタンパク質を精製することで、ネイティブホモおよびヘテロSNX-BARダイマーを取得し、非ネイティブ発現系で頻繁に遭遇する毒性と不溶性を最小限に抑えることができます。
我々の方法は、すべての酵母SNX-BARの脂質特異性を理解したり、他の生物から組み換えSNX-BARタンパク質を産生するために使用することができる。押出プロセス中のリポソーム損失を防ぐためには、正しい押出機アセンブリが不可欠です。初めに学生や現場に初めて参加する学生にとって、最も重要なステップを視覚的に観察することで、成功の可能性が大幅に向上します。
まず、炭素源として2%ラフィノースと0.1%グルコースを添加した50ミリリットルの標準的なYP培地を含む培養物の少なくとも4倍の量のフラスコに酵母細胞の大きな綿棒を接種し、30°Cシェーカーで一晩培養を成長させます。翌朝、2%ラフィノースと0.1%グルコースを2.8リットルの容量で2.8リットルバッフルフェルバックフェルンバッハフラスコで1リットルの標準YP培地で50ミリリットルの前培養を発振インキュベーターで4〜5時間培養する。600ナノメートルでの光学濃度が0.2に達すると、揺れインキュベーターで一晩培養するために、細胞に2%の最終濃度にガラクトースを加えます。
翌朝、遠心分離によって細胞を収穫し、酵母ペレットを50ミリリットルの円錐形チューブに移す。ペレットを精製バッファーの 15 ミリリットルに再懸濁して約 30 ミリリットルの最終容積を達成し、セル懸濁液を摂氏 4 度に冷却したホモジナイザーにロードします。サンプルを2〜3ラウンドで1平方インチあたり20〜25,000ポンドでライセし、氷の上の新しい50ミリリットル円錐形チューブにライセートを移します。
すぐに遠心分離によって細胞のライセートをクリアし、慎重に新しいチューブに上清を移します。次に、精製バッファーに3つの再懸濁液を有するIgGセファロースビーズの300マイクロリットルを平衡化してから、ビーズをクリアした細胞のライセートに加え、摂氏4度で回転して2時間のインキュベートを行います。インキュベーションの最後に、ビーズを10ミリリットルのクロマトグラフィーカラムに加え、非結合溶解物が流れるようにします。
ビーズを洗浄ごとに1ミリリットルの洗浄バッファーで10回洗浄し、各洗浄液が完全に流れ込んでから次のボリュームを追加します。最後の洗浄後、ピペットと新鮮なバッファーを使用して、マイクロ遠心チューブにビーズを移します。新鮮な洗浄バッファーでビーズの総量を500マイクロリットルにし、4°Cで回転して一晩インキュベーションのために1ミリリットルTEVプロテアーゼあたり10ミリグラムの2マイクロリットルでリゼートからビーズを取り除きます。
翌朝、27ゲージの針を使用して上清を完全に除去し、タンパク質の純度を10%ポリアクリルアミドSDSページで評価します。次に、標準プロトコルに従ってブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して濃縮タンパク質を定量化し、摂氏4度で最大1週間タンパク質を保存します。リポソームを調製するために、ガラス注射器を使用して、ストック脂質をクリーンガラス培養チューブに移し、1%ホスファチジルイノシトール-3-リン酸、20%エルゴステロール、30%ホスファチジルセリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンを表に概説した最終脂質混合物を達成する。
各脂質が再懸濁される溶媒に応じて、混合物は各脂質の添加時に白濁し得る。低流量の窒素ガスを円運動で導き、ガラス管の底部で脂質を均一に処理することで、脂質混合物を慎重に乾燥させます。次に、開口部を覆い出したホイルでガラス培養チューブを包み、さらに1時間真空中で脂質を脱水します。
インキュベーションの終わりに、各バイアルに400マイクロリットルの結合バッファーを加えて、最終的なリポソーム濃度2.5ミリモルで脂質を完全に水分補給してから、室温で渦中速度で脂質を30分間再懸濁します。脂質が再懸濁されると、バッファーが濁るはずです。再懸濁リポソームをマイクロ遠心分離チューブに移し、液体窒素でチューブを凍結し、続いて37°Cの水浴で解凍を7〜8回行います。
化学フュームフードでは、1回のクロロホルムを1回3回フルボリュームで2本洗浄し、残留脂質を除去し、2体積の超純水と2体積の結合緩衝液で各シリンジを平衡化します。メーカーの推奨に従ってミニ押出機を組み立てます。次に、結合バッファーに 1 つの 200 ナノメートル膜に 2 つのフィルターサポートを水没します。
完全に気密になるようにミニ押出機を組み立てることが重要です。そして、リークをチェックする良い方法は、デバイスを介してバッファを渡すです。フィルターサポート間の膜を挟み、ミニ押出機に膜を配置します。
平衡化された1ミリリットルシリンジの1つを使用して、ミニ押出機を通してリポソーム混合物の体積に類似した結合バッファーのボリュームを渡し、他のシリンジを使用してマイクロ遠心分離チューブを反転させ、リポソームチューブの最後を収集してそのコレクションのチューブキャップに取り込みます。その後、200ナノメートル膜を通してリポソームを19〜21回押し出し、押し出されたリポソームを新しいマイクロ遠心チューブに集める。SNX-BARのリポソーム結合および細管アッセイを行う前に、精製したタンパク質を超遠心分離によって予めクリアし、ペレットを邪魔することなく上清を新しいマイクロ遠心管に移します。
次に、精製されたSNX4-ATG20の4マイクロモルと2.5ミリモルのリポソームを合計20マイクロリットルの30分の摂氏でインキュベートします。リポソーム細管を視覚化して定量化するには、インキュベーションの終わりに、炭素被覆銅メッシュグリッドと1%の酢酸ウラニルとの負の汚れにサンプルをすぐに見つけます。その後、200キロボルトで透過型電子顕微鏡でサンプルを分析します。
リポソーム結合および沈下のために、ポリカーボネート遠心管に反応の20マイクロリットルを移し、超遠心分離機で互換性のあるルータでサンプルを回す。遠心分離の終わりに、上清を新しいマイクロ遠心分離管に慎重に移し、SDSページサンプルバッファーの40マイクロリットルでペレットを再懸濁します。ペレット懸濁液を新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、20マイクロリットルのサンプルバッファーを上清に加えます。
その後、10%ポリアクリルアミドSDSページゲルに同等のサンプル量のペレットと上清をロードし、リポソームに結合したSNX-BARsを可視化するためにクーマシー染色を行います。SNX-BAR発現の適切な誘導を確認するために、タンデムアフィニティー精製タグに対するウェスタンブロットは、クーマシー染色を介してSNX-BARのタンパク質レベルを検出できない可能性があるため使用できます。SNX-BARヘテロダイマーの精製後、2つのSNX-BARのバンドは1対1の量論比で現れ、汚染バンドはほとんどまたは全く存在しないはずです。
この代表的な分析では、SNX-BARヘテロダイマーを発現させ、精製し、実証したように合成リポソームに結合した。なお、MVP1はホモダイマーを形成し、期待通り細菌で発現した。SNX-BARは、様々なリポソーム組成物に結合し、例えばリポソーム結合に対するホスファチジルセリンの影響を評価するために、デンジソメトリーによって定量化することができる。
電子顕微鏡イメージングは、通常14〜26ナノメートルの間の直径を有するほとんどの管管を有するSNX4-ATG20リポソーム細管の測定を可能にする。精製されたSNX-BAはリポソームの貨物捕獲複合体で再構成され、完全なアセンブリが膜のリモデリングに与える影響を理解することができることに注意してください。精製されたSNX-BARダイマーの異なる組み合わせと異なる脂質で構成される合成リポソームとの結合を比較した場合、SNX-BARタンパク質は、明確な脂質結合性の好みを有することが判明した。
クロロホルムを扱う際は常にフードで作業し、シャープやガラス材料を扱う際には適切なPPEを着用してください。
