私たちの環境には、主にエストロゲン物質のEDC化学物質が多く存在します。グループに属する物質の化学的多様性は、その検出に異なる方法が必要なため、試験を困難にします。化学構造に基づいて、物質が実際にエストロゲンとして働くことができるかどうかを判断することは本当に困難です。
また、これらの物質は環境中で純粋な形で存在することはないので、その効果は他の化合物の影響を受ける可能性があります。この問題は、バイオモニター、エストロゲン効果を示す生体標識生物の使用などの効果の方言方法によって解決される。特定の遺伝子が生体内のエストロゲンに敏感に反応することが知られています。.
分子法による遺伝子産物の検出は、タンパク質またはmRNAレベルでも可能であるが、通常は動物の犠牲を伴う。動物保護法は厳しくなりつつあり、代替試験システムに対する需要が高まっています。この開発と蛍光タンパク質の発見により、バイオマーカーの作成方法が開拓されたのが、遺伝子組み換え技術の可能性を表しています。
このようなエストロゲン感受性遺伝子の活性化の助けによって、生体内で試験することができる。このビデオでは、vtg:1mCherryトランスジーンゼブラフィッシュ胚の使用のための可能な方法は、2つの化合物の助けを借りてエストロゲン物質のテストのために示されています。このプロトコルは、バイオマーカー胚に対する異なる化学的または環境サンプルのエストロゲン効果を研究するための背景として機能することができます。
私たちの実験で使用されるゼブラフィッシュラインは、ビテロゲニンレポータートランスジェニックゼブラフィッシュラインです。このラインは、Tol2 トランスポゾン システムを使用して作成されました。開発に使用されるトランスジーン構築物は、長い天然のビテロゲニン-1プロモーター配列を運び、多くのERI側を有する。
性的に成熟した女性における蛍光シグナルの発現は連続的である。しかし、胚の雄では、エストロゲン物質の作用または存在によってのみ現れるため、後者は検査に適している。ラインの胚の感受性および使いやすさは、いくつかのエストロゲン性化合物および環境サンプルでテストされている。
生きた動物に関するすべての実験はハンガリー動物福祉法に従って行われ、動物が無料の給餌段階に達する前にすべての研究が完了した。システム水で交配タンクを満たし、卵を収穫する前に交配するための魚を設定します。雄と雌の魚をタンクに入れ、仕切りの助けを借りてそれらを分離します。
翌朝のライトのスイッチとして、タンクから仕切りから仕切りを取り外します。15~20分ごとに卵の交配タンクを確認してください。すべての胚をティーストレーナー、または密に織られた細かいメッシュを使用して収穫し、E3バッファー、または透明なシステム水を備えた1つの大きなペトリ皿に組み合わせます。
胚を25.5°Cに設定したインキュベーターに入れる。1~1時間半後、未受精の卵子を取り除いて捨てるか、プラスチック転写ピペットを解剖顕微鏡で不十分に分割した。選択した胚を治療容器に入れ、例えばペトリ皿や組織培養プレートに入れ、すでに標識され、異なる濃度の被験物質で満たされている。
実験が終わるまで、胚を摂氏25.5度でインキュベートする。処理濃度を維持するために必要な場合は、試験溶液をリフレッシュしてください。胚に損傷を与えないように、試験溶液を交換する際には注意してください。
事前にms 222で4%のメゲスラドースを準備してください。5日齢の幼虫をプラスチックピペットで治療グループあたり5センチメートルのペトリ皿に入れます。プラスチックピペットで幼虫から治療溶液を取り出し、ペトリ皿に0.02パーセントms 222麻酔液の2ミリリットルを充填します。
特別に設計された10センチメートルのペトリ皿の各正方形を4%のメナスラドースms 222で満たします。麻酔をした幼虫を、2つの正方形の1つに少量の水でメネスラドースに移します。最初の正方形から、幼虫を2番目の正方形に移します。
2番目の正方形では、幼虫を左側に回転させて向き、マイクロローダーのピペットチップを2センチメートルまでカットして底までそっと押し下げます。発現したレポーターの信号を評価するために、同じビューと設定で胚を画像化する。ペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。
胚の肝臓に焦点を当て、関連するソフトウェアを使用して明るいフィールド画像をキャプチャします。顕微鏡をmCherryフィルターに切り替え、関連ソフトウェアを使用して蛍光灯下の肝臓の蛍光画像を撮ります。実験ですべての胚をキャプチャするまで、前の 2 つの手順を繰り返します。
他のチャンネルを閉じます。画像内に同様のサイズの楕円領域を指定して、完全な信号が評価に干渉しないようにします。楕円形のツールを使用すると、ハイライト表示された肝臓領域の上に楕円をできるだけ正確に描画します。
シグナルが弱い場合は、光微視画像、蛍光画像の明視野対を用い、肝臓の位置を決定する。[解析]、[測定]をクリックして、信号強度と影響を受けた領域のサイズを決定します。統合密度値は、グラフのソフトウェア列によって自動的に計算されます。
治療群内のすべての胚のすべての蛍光画像を分析するまで、前の手順を繰り返して分析を続けます。データを保存し、統合密度値を分析します。実験では、バイオマーカーゼブラフィッシュラインのエストロゲン感受性胚を、5日間までの受精のためにαおよびβ-ゼアラレノール(ZOL)の0.5および8マイクロモル濃度で処理した。
我々は、物質による実験の終わりまでに魚の肝臓に花性シグナルが現れるかどうか、そして2つの物質のエストロゲン性に違いがあるかどうかを調べた。結果は蛍光画像と積分濃度値に基づいて評価した。α-ZOLの場合、最も高い試験濃度で、すべての個体が死亡した。
したがって、この場合、蛍光シグナルを検査できませんでした。より低い濃度では、強い蛍光シグナルが胚の肝臓で観察することができる。蛍光信号の強さと照らされた領域の大きさに大きな差がない。
また、積分密度値と治療の間にも有意な差はなかった。β-ZOLによる治療中に死亡率はなかった。この物質は、すべての治療濃度におけるトランスジーン活性を誘発した。
蛍光シグナル強度の増加、および照光領域の大きさは、濃度が増加するにつれて蛍光画像で観察することができる。β-ZOLの統合値を調べることで、この変化も発見できる。平均積分密度値は、最低の処理濃度と最高の処理濃度の間でほぼ2倍になります。
しかし、β-ZOLの場合、個々の濃度の積分密度値に有意差は見つからなかった。2つの物質の同じ処理濃度から得られた積分密度値を調べることにより、α-ZOLはβ-ZOLに対して各症例においてより高い集積密度平均を与え、蛍光画像で観察されるシグナル強度の差と一致していると言える。すべての濃度で有意なこの違い.
エストロゲンの効果のための生体指標の使用は、毒物学的研究で広がっています。.エストロゲンの効果を示すいくつかのトランスジェニックラインもゼブラフィッシュから生成されています, そのうちの vtg:1mCherry は、我々の研究で使用されました..ここで説明する方法は、純粋な薬剤の場合にエストロゲン活性をインビボで検出できるようにするために、このラインの胚の試験のための可能なプロトコルを示す。
胚の場合、トランスジーンの発現は、内因性のビテロゲニンの産生と同様に、大きな分散を示し、実験を設計する際に個人感度の違いを考慮する必要があることを言及することが重要である。治療濃度を決定する上で重要な側面は、肝細胞を含む胚の細胞は、より高い濃度の毒性物質によって損傷を受け、ヴィテロゲニン誘導の減少につながる可能性があるということです。したがって、テストはL-C 10未満の濃度で行われるべきです。
このプロトコルは、計画されたテスト エンドポイントに従って、テスト対象のサンプルに応じて多くのポイントで変更できます。それは、他の試験方法、例えば分子法で完了することができる。このように、vtg:1mCherry ラインの使用がエストロゲン性検定のモデルとして現れ、標準化されたテスト方法のモデルになる可能性があることを期待しています。
