これらの方法は、神経芽細胞腫転移の最初のゼブラフィッシュモデルを開発するために使用された。そして、このモデルが神経芽細胞腫のリスクが高い患者に見られる転移の多くの特徴を忠実に再現できることを実証する。この転移性ゼブラフィッシュモデルの主な利点は、腫瘍播種をリアルタイムでin vivoでイメージングして、転移がいつ、そしておそらくどのように起こるかをよりよく理解できることです。
この技術は神経芽細胞腫に特有のものではありません。これは、腫瘍細胞が同定され、追跡され、一連の可能性につながる限り、多様なタイプの癌のゼブラフィッシュモデルに適用することができる。まず、MYCNとLMO1トランスジェニック系統を交配させることによって、MYCNとLMO1の両方を過剰発現するヘテロ接合型トランスジェニック魚系統を開発する。
受精後のある日、実体蛍光顕微鏡を使用して、EGFP発現のためのアウトクロスの子孫を分類し、EGFP陽性点として提示する。選別後、スクリーニングした胚を別々のペトリ皿に単離し、皿をMYCN陽性またはMYCN陰性としてラベル付けする。受精後3~4日でLMO1発現について両群の胚を可視化・選別する。
上頸部神経節と非PSNSドーパミン作動性神経細胞の両方、特に後脳の延髄質に赤い蛍光斑点を探してください。胚が受精後5日に達する前にスクリーニングを行う。次に、選別した魚を異なる遺伝子型の4つのグループに分離し、MYCNのみ、LMO1のみ、MYCNおよびLMO1の両方および野生型としてラベル付けする。
標準プロトコルに従って同じ条件でそれらを育てます。両側の金属ヘラで魚を優しくひっくり返して実体蛍光顕微鏡で腫瘍を可視化し、腫瘍を表示します。可能性のある腫瘍性魚を同定した後、生年月日、腫瘍がスクリーニングされた日付、および遺伝子型を含む適切なラベルでそれらを別のタンクに単離する。
受精後6週間で、前のステップを繰り返して、担がん魚と非担がん魚をスクリーニングし、以前にスクリーニングした魚の腫瘍の存在を確認するか、または新しい可能性のある担がん魚を同定する。蛍光陽性塊の持続または増加したサイズを探し、腫瘍を有する魚を確認した。担がん魚を同定した後、腫瘍細胞遊走の証拠について隔週でそれらを監視しますが、これは腫瘍発生の原発部位から遠く離れた小さなEGFPまたはmCherry陽性腫瘍塊として提示されます。
必要に応じてこれらの魚を別々のタンクに隔離し、転移の可能性を示すために適切にラベルを付けます。LMO1魚類におけるヘテロ接合型MYCNを解釈した後、それらの子孫を選別しながら、受精後1日で非PSNSドーパミン作動性神経細胞においてEGFP MYCN発現が顕著であった。対照的に、LMO1発現は、PSNS細胞および非PSNSドーパミン作動性ニューロン細胞の両方で顕著であった。
蛍光陽性腫瘍塊は、MYCNおよびLMO1の両方の過剰発現を有する化合物トランスジェニック魚の原発腫瘍部位から離れた器官の組織において検出されたが、MYCN単独の発現を有するトランスジェニック魚では検出されなかった。手術切片のH&E染色は、原発性腫瘍が神経芽細胞腫患者における原発疾患の最も一般的な部位であるヒト副腎と同等のゼブラフィッシュである腎間領域から生じたことを示している。腎間腺から離れた腫瘍塊は、腎臓の遠位部、眼窩、えら、脾臓、および心臓の心房室の内壁を含む複数の領域で検出された。
原発巣および全ての転移部位における腫瘍細胞のPSNS神経芽細胞系統が確認された。有意に増幅された量およびPSR染色コラーゲン線維の厚さの増加は、MYCNのみを発現する腫瘍と比較した場合、MYCN LMO1腫瘍において見出された。この手順を使用した後、薬物スクリーニングおよび新規がん治療法の試験を適用することができ、転移性がんを予防および治療するための代替薬剤の開発につながる可能性があります。
