このプロトコルは、私たちが費用対効果の高い方法で遺伝子組み換え動物を活用することを可能にする喉頭細胞狭窄症の小さな動物モデルで薬物溶出ステントを調査することができます。薬物溶出気道ステントの経方向配置は、喉頭内膜狭窄のより臨床的に関連するモデルを表す気管への開放から動物を惜しむ。この技術は、喉頭内症狭窄を治療するための局所的な薬物送達戦略の前臨床調査を容易にする。
この技術は、より大きな動物モデルおよび臨床応用における将来の調査に適用することができる小さな動物モデルにおける薬物溶出気道ステントの翻訳的調査のための実行可能で効果的なプラットフォームを提供する。技術は特に経経口挿管、気管損傷の誘導、および気道ステント配置工程。この技術的に困難な手術の視覚的なデモンストレーションは、細かい詳細の多くが言葉で完全に記述することができないので重要です。
ポリマー溶液を含む1%ラパマイシンを作るために、ガラスバイアルに70-30 PLLA-PCLの600ミリグラムにラパマイシンの6ミリグラムを追加します。フュームフードの下で、6ミリリットルのジクロロメタンをラパマイシンに加え、バイアルを制御し、各バイアルに120マイクロリットルのグリセロールを加えます。その後、バイアルをキャップし、PLLA-PCL溶液が室温で6〜12時間均質化できるようにします。
無菌材料と技術を使用して、マウス気道ステントを作成するには、カテーテルの回転を遅くしながら、22ゲージフルオロリンエチレンプロピレンベースのアンジオカテーテルの静脈カニューレにPLLA-PCL溶液を補充したラパマイシンの1ミリリットルを塗布する。すべての溶液が適用されたら、アンジオカテーテルの先端を下向きにして成形された血管カテーテルを、真空フードのガラスペトリ皿の端にあるカテーテルのヒルトを支えます。室温で真空状態で24時間後、乾燥したステントコンストラクトからカテーテルを軽くねじってスライドさせ、ステントに対して、鋳造プロセス中に生じた欠陥がないか周回チェックします。
視覚化を支援するために、ステントの長さに細い黒い線を引くのが役に立ちます。エッジが軸になるように細かいストレートハサミでキャストされたステントの両端をトリミングし、ハサミを使用して各ステントを3ミリメートル軸セグメントにカットします。次に、3ミリメートルのステントを新しい22ゲージ静脈カテーテルに積み込みます。
喉頭筋狭窄誘発の場合、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、最初のマウスを上端の外科プラットフォームに置き、中央切歯の周りのプラットホームの上部に付けられた小さな糸をループする。テープでテーブルに手足を固定し、マウスの首に1.5センチメートルの正中線垂直切開を行います。上に回っている胸腺を分割し、気管を視覚化するために得られた2つの葉を横化します。
上にある上にあるステルノヒロイドとステノ甲状腺の筋肉を両側で上の付着で分け、喉頭を通して経道的に22ゲージの血管カテーテルを気管に渡す。小さな鉗子を使用して、カテーテルの正しい配置を助けるためにマウスの前喉頭に圧力をかける。正しく配置された血管カテーテルは、気管を通して白色で視覚化することができます。
損傷を誘発するには、挿入された血管カテーテルを通してブレオマイシンコーティングワイヤーブラシを渡し、ワイヤーブラシだけが気管内に残るようにカテーテルをゆっくりと引き出します。細かい鉗子を使用して、ブラシの上に気管にカテーテルを再挿入する前に、ブラシで気管内腔を機械的に破壊するために気管に対する対圧を適用します。ワイヤーブラシを取り外し、先に示したようにブラシを4回挿入して取り外す前に、Bleomycinを再適用します。
最後のブレオマイシンの塗布後、気管からカテーテルを取り除く。PLLA-PCLの経方向配置では、細い黒い垂直線が各ステントに組み込まれていることを確認し、プリロードされた血管カテーテルでマウスを経方向に挿管します。ステントは、経頸部切開を通して気管内で視覚化されるべきである。
ステントが設置されている場合は、細かい鉗子を使用して、切開を通して気管をしっかりとしっかりとつかんでステントを所定の位置に保持し、カテーテルを取り外します。ステントはできるだけ注意深く配置することが重要です。気管に圧力がかかりすぎると、ステントが崩壊し、気道閉塞や動物の死を引き起こす。
ここで使用する組織接着剤または吸収可能な4-0クロミック縫合糸で切開を閉じ、マウスが動物を自宅のケージに戻す前にモニタリングして回復できるようにします。適切な実験エンドポイントで、目的のマウスを手術用プラットフォーム上のスピーヌ位置に置き、細かい湾曲した虹彩はさみを使用して切開を再開します。実演したように気管を露出し、はさみを使用してステントのレベルより下の遠位気管を分割します。
次に、近位気管を喉頭の下とステントの上に分け、分割された気管を食道から後道から後で分離する。次に気管からステントを取り出し、気管を10%ホルマリンで24時間固定します。この研究で使用されるPLLA-PCLステント構築物をロードした生分解性ラパマイシンは、生理学的条件下で一貫した予測可能な方法でラパマイシンを溶出することができる。
この画像では、微細化された生体適合性ステントは、半透明のマウス気管を介して視覚化されたステント上の黒いマーカーによって示されるように、気管内のその場で観察することができる。21日後、黒色の染料マーカーを使用して、気管内のステント位置の維持を確認することができます。急性および慢性炎症のマーカーに免疫蛍光染色を用いた生体適合性試験は、PLLA-PCLステント構築物が、傷害の不在時に配置後に存在する最小限の免疫細胞数によって決定される免疫反応性ではないことを示している。
繊細でトラウマ的な方法で気道を操作することは、手順の成功に不可欠です。過剰な力、複数の挿管、ステントの崩壊は、動物の死につながる可能性があります。ラパマイシン溶出ステントでの治療後、生存率の評価、定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現、フローサイトメトリー、ELISA、免疫体化学を含む免疫測定が行える。
マウスモデルにおける薬物溶出のプラットフォームを成功に導くため、この技術は喉頭療法狭窄症における局所応用治療薬の将来の調査への道を開く。ジクロロメタンは腐食性液体です。常にヒュームフード、個人用保護具、非腐食性材料を使用してください
