Этот протокол позволяет исследовать наркотики-eluting стенты в небольшой модели животных ларинготрахеального стеноза позволяет нам использовать генетически модифицированных животных в экономически эффективным способом. Трансорального размещения лекарственно-eluting стента дыхательных путей избавляет животных от открытого разреза в трахею, представляющих более клинически релевантную модель стеноза ларинготрахея. Этот метод облегчает доклинкическое исследование местных стратегий доставки лекарств для лечения стеноза ларинготрахея.
Этот метод обеспечивает осуществимую и эффективную платформу для трансляционного исследования лекарственно-элутных стентов дыхательных путей в модели малых животных, которые могут быть применены для будущих исследований в более крупных моделях животных, а также клинического применения. техника, в частности, трансоральной интубации, индукции травмы трахеи, и шаг размещения стента дыхательных путей. Визуальная демонстрация этой технически сложной операции имеет решающее значение, поскольку многие мелкие детали не могут быть полностью описаны словами.
Чтобы сделать 1%рапамицин, содержащий полимерный раствор, добавьте шесть миллиграммов рапамицина в 600 миллиграммов 70-30 PLLA-PCL в стеклянный флакон. Под капотом дыма добавьте шесть миллилитров дихлорметана в рапамицин, дополните и контролйте флакон и добавьте 120 микролитров глицерола к каждому флакону. Затем крышка флаконы и позволяют PLLA-PCL решение гомогенизировать в течение шести до 12 часов при комнатной температуре.
Чтобы создать стент murine airway, используя стерильные материалы и технику, нанесите один миллилитр рапамицина дополнил раствор PLLA-PCL на венозную канюлю 22-го калибра фторированного этиленового пропилена на основе ангиокатетера при замедлении вращения катетера. Когда все решение было применено, опора формованных ангиокатетер с кончиком ангиокатетера лицом вниз и рукоятка катетера на краю стеклянной чашки Петри в вакуумном капюшоне. После 24 часов в вакууме при комнатной температуре, осторожно крутить и скользить катетер из высушенного стента конструкции и окружно проверить стент на наличие дефектов, которые могут возникнуть в процессе литья.
Чтобы помочь в визуализации, полезно нарисовать тонкую черную линию по длине стента. Обрезать каждый конец отлитых стентов с мелкими прямыми ножницами, так что края являются осяными и использовать ножницы, чтобы разрезать каждый стент на три миллиметра осяных сегментов. Затем загрузите каждый трехмиллиметровый стент на новый 22-го калибровочный венозный катетер.
Для индукции стеноза ларинготрахея, после подтверждения отсутствия реакции на щепотку носка, поместите первую мышь на хирургическую платформу в положении на спине и петля небольшой кусок нити, прикрепленной к верхней части платформы вокруг центральных резцев. Защитите конечности к столу лентой и сделайте 1,5-сантиметровый вертикальный разрез в шее мыши. Разделите чрезмерного тимуса и боковой двух результирующей доли, чтобы визуализировать трахею.
Разделите чрезмерно sternohyoid и стернотиреоидных мышц на верхней привязанности на двусторонней основе и пройти 22 калибровочный ангиокатетер транснорально через гортань в трахею. Используя небольшие типсы, нанесите давление на переднюю гортань мыши, чтобы помочь в правильном размещении катетера. Правильно размещенный ангиокатетер можно визуализировать по белому цвету через трахею.
Чтобы вызвать травму, пройти Bleomycin покрытием проволоки кисть через вставленный ангиокатетер и медленно снять катетер так, что только проволока кисть остается в трахее. Используя тонкие типсы, нанесите контрпрессура на трахею, чтобы механически нарушить трахею люмена с кистью, прежде чем восстановить катетер в трахею над кистью. Удалите проволочную щетку и повторно блеомицин перед вставкой и удалением кисти еще четыре раза, как только что продемонстрировано.
После последнего применения блеомицина снимите катетер с трахеи. Для трансорального размещения PLLA-PCL убедитесь, что тонкая черная вертикальная линия была включена в каждый стент и трансориально интубировать мышь с предварительно загруженным ангиокатетером. Стент следует визуализировать в трахее через трансцервический разрез.
Когда стент на месте, используйте тонкие типсы твердо, но осторожно схватить трахею через разрез, чтобы держать стент на месте и удалить катетер. Очень важно разместить стент как можно тщательнее. Слишком большое давление на трахею приведет к обрушению стента, вызывая обструкцию дыхательных путей и смерть животного.
Закройте разрез с помощью тканевого клея или абсорбируемых 4-0 хромических швов, используемых здесь, и позвольте мыши восстановиться с наблюдением перед возвращением животного в свою домашнюю клетку. В соответствующей экспериментальной конечной точке, поместите мышь интерес в положении на спине на хирургической платформе и использовать тонкие изогнутые ножницы радужной оболочки глаза, чтобы вновь открыть разрез. Разоблачить трахею, как попродемонстрировано, и использовать ножницы, чтобы разделить дистальной трахеи ниже уровня стента.
Затем разделите проксимальную трахею ниже гортани и над стентом и отделите разделенную трахею от пищевода задним окт. Затем удалить стент из трахеи и исправить трахею в 10%формалин в течение 24 часов. Биоразлагаемый рапамицин загружен PLLA-PCL стент конструкция, используемая в этом исследовании способен eluting рапамицин в последовательной и предсказуемой моды в физиологических условиях.
На этом изображении миниатюрный биосовместимый стент можно наблюдать на месте в трахее, о чем свидетельствует черный маркер на стенте, визуализирован через полупрозрачную мышеловку. Через 21 день маркер черного красителя может быть использован для подтверждения поддержания положения стента в трахее. Тестирование биосовместимости с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания для маркеров острого и хронического воспаления показывает, что стент PLLA-PCL конструкция не иммунореактивна, как это определено минимальным количеством иммунных клеток, присутствующих после размещения при отсутствии травмы.
Манипулирование дыхательными путей в деликатной и атрауматической моды имеет решающее значение для успеха процедуры. Чрезмерная сила, множественные интубации и коллапс стента могут привести к гибели животных. После лечения рапамицин-элутинг стент, оценка выживаемости, экспрессия генов с помощью количественных ПЦР в режиме реального времени, иммуноанализ, включая цитометрию потока, ELISA, и иммуногистохимии могут быть выполнены.
Как она обеспечивает успешную платформу для наркотиков элюции в мышиной модели, этот метод прокладывает путь для будущих исследований местной прикладной терапии в ларинготрахеальный стеноз. Дихлорметан является коррозионной жидкостью. Обязательно используйте дымовой капот, средства индивидуальной защиты и некоррозионные материалы
