このプロトコルは、脱上皮化および気道組織再生などの異なる組織操作手順中に、インビトロ培養および単離された気道組織の直接顕微鏡可視化を可能にする。この研究で提案されたin situイメージングは、内因性上皮のイメージング誘導制御された除去および外因性細胞の送達中の気管内腔の迅速かつ非破壊的なモニタリングを可能にする。イメージング誘導生体反応性プラットフォームおよび組織操作プロトコルを使用して、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングのための生体工学的気道組織を生成することができる。
イメージング対応気道組織バイオリアクターの構築と使用は、私たちの研究グループの2人の博士課程の学生、Mohammad MirとJiawen Chenによって実証されます。in situ撮像素子の作成を開始するには、積み重ね可能なレンズチューブにチューブレンズを挿入し、保持リングを使用して固定します。次に、レンズテーブルアセンブリをCマウントアダプタを介して科学CMOSカメラに取り付けます。
Micromanagerソフトウェアを使用してカメラを操作し、写真やビデオを取得します。カメラから10メートルの位置にある物体を狙いながら、コンピュータ画面に物体の集光画像が形成されるまで、チューブレンズとカメラの撮像センサとの距離を調整します。次に、アセンブリロッド、ねじ付きケージプレート、ケージキューブなどの光学ケージシステムコンポーネントを使用して、デュアルエッジ、超解像ダイクロイックミラーにフィルターレンズを取り付け、レーザーをデバイスに取り付けます。
20倍の対物レンズをデバイスに接続します。次に、X-Y変換器を介してレンズ管の先端に直径500マイクロメートルの緑色のレンズを取り付けます。緑色レンズと対物レンズの間の距離を調整して、焦点を絞った顕微鏡画像を形成します。
単離されたラット気管内腔を明視野または蛍光で視覚化するには、バイオリアクターをイメージングステージ上に置きます。次に、新たに調製したカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、またはCFSE溶液500マイクロリットルを、気管カニューレのチューブに接続されたシリンジポンプを介して気管を通して毎分5ミリリットルの流量で注入する。CFSE溶液が気管を満たしたら、ポンプを停止します。
10分後、シリンジポンプを用いて10ミリリットルのPBSを注入して気管内腔を洗浄し、残留未配合のCFSE試薬を除去した。洗浄後、緑色レンズの遠位結像端を気管の一端に取り付けられたルアーコネクタを介して気管内に挿入する。その後、気管表面が焦点を合わせるまで緑色のレンズを気管内部に静かに動かす。
マイクロマネージャソフトウェアで明視野画像をキャプチャするには、ケージキューブを通して気管内腔を白色光で照らします。次に、ライブアイコンをクリックして、気管の内腔表面をリアルタイムで表示します。[イメージング]タブと[露出]タブを使用して、露光時間を目的の値に変更します。
画像のコントラストと明るさを調整するには、ヒストグラムと強度スケーリングウィンドウを使用して、インタラクティブなヒストグラム表示の終点で白黒矢印を移動します。「ライブを停止」をクリックしてスナップアイコンをアクティブにし、「スナップ」アイコンをクリックして画像をフリーズします。次に、[エクスポート]、[画像を置き換えタブとして]の設定を使用して、画像を目的の形式で保存します。
蛍光モードで写真やビデオを取得するには、ケージキューブを通してCFSE固有のレーザー光で気管内腔を照らし、イメージングプローブを前後に動かしてリアルタイムで画像を取得します。写真やビデオが得られたら、緑色のレンズを気管からそっと取り外します。気管の脱上皮化のために、新たに調製した2%ドデシル硫酸ナトリウム50マイクロリットルを気管カニューレを通して注入し、気管内腔上に洗剤溶液の薄膜を生成する。
点眼後、オスまたはメスのルアープラグを使用してバイオリアクターのチューブ接続を閉じ、バイオリアクターを摂氏37度のインキュベーターに10分間移して、SDSが気管内に滞留できるようにします。点眼を1回繰り返します。2回目の点眼後、毎分10ミリリットルの流量でシリンジポンプを介して500マイクロリットルのPBSで気管内腔を3回灌漑することによって溶解した上皮およびSDSを除去する。
次に、バイオリアクターをシェーカー上に置き、20ヘルツの周波数および0.3ミリメートルの変位振幅で機械的に振動させ、SDS処理上皮細胞の気管内腔からの剥離を物理的に促進する。気管が機械的に振動している間に、気管内腔を通して500マイクロリットルのPBSを2回点眼し、残留SDSおよび細胞破片を除去する。上皮除去に続いて、緑色レンズ撮像素子を用いてCFSEの強度を測定することにより上皮層のクリアランスを評価する。
脱上皮化ラット気管を調製した後、凍結間葉系幹細胞(MSC)を摂氏37度の水浴中で30秒間融解する。次いで、血球計数器で細胞を計数し、続いて、1ミリリットルあたり6個の細胞に対して10倍から5倍の濃度の細胞溶液を調製した。次いで、細胞を室温で2ミリリットルの100マイクロモルCFSE溶液と共にインキュベートすることによって、細胞を蛍光的に標識する。
15分後、細胞を5ミリリットルのPBSで3回すすぎ、その後、1ミリリットルあたり7個の細胞に対して10倍から3回の終濃度で新鮮なDMEM培養培地に再懸濁した。コラーゲンIヒドロゲルの調製直後に、原稿に記載されているように、細胞を所望の濃度のヒドロゲル溶液に加える。次いで、細胞とゲル溶液とをマイクロピペットで混合し、均一な細胞ヒドロゲル混合物を得た。
次に、バイオリアクター内の気管の一端をルアーコネクタを介してプログラム可能なシリンジポンプに取り付け、5ミリリットルの新鮮な培養培地を摂氏37度のバイオリアクターチャンバーに送達して気管の外面を覆う。次いで、細胞ヒドロゲル混合物のボーラス10マイクロリットルをバイオリアクター内の脱上皮化気管内に投与し、気管内腔上に細胞ヒドロゲル層を生成する。細胞注入後、バイオリアクターを摂氏37度および5%二酸化炭素の滅菌細胞培養器に入れ、ゲレーションのために30分間ゲレーションを行い、ゲレーションを可能にする。
移植細胞の分布を可視化するには、緑色のレンズを70%イソプロピルアルコールまたはエタノールで滅菌し、バイオリアクターをイメージングステージに置き、明視野モードと蛍光モードの両方で写真とビデオを取得します。30分間の細胞播種後、毎分1ミリリットルの流速で1ミリリットルの培養液を気管内腔に注入する。最後に、バイオリアクター内の細胞播種気管を摂氏37度のインキュベーター内で所望の時間培養する。
細胞培養中、内腔内の培地を静的に保ち、気管の外側の培地は一方向の流れを介して連続的に灌流される。脱上皮化気管の明視野および蛍光画像において、CFSE標識の前に蛍光シグナルは観察されなかった。CFSEでは、上皮全体で均一な蛍光シグナルが観察された。
脱上皮化後、蛍光強度は有意に減少し、上皮のアブレーションを示した。脱上皮化気管のヘマトキシリンおよびエオジン染色は、気管内腔からの擬似重層化上皮の除去、および下層の組織層における細胞および細胞外マトリックス、またはECM微細構造の保存を例示した。また、ペンタクロームおよびトリクロム染色により、コラーゲンやプロテオグリカンなどの気管組織構造やECM成分の維持が確認された。
上皮細胞およびコラーゲンの免疫蛍光により上皮の完全な除去および上皮下組織内のコラーゲンIの保存が明らかになった。走査型電子顕微鏡写真は、天然の気管に多毛および杯細胞が移入されていることを示した。脱上皮化気管では、細胞外マトリックス線維のメッシュネットワークおよび上皮細胞の不在によって示されるように、基底膜が露出した。
脱上皮化気管の蛍光画像を、PBSおよびコラーゲンで播種した際に、ここに示している。培養液を介して播種された細胞と比較して、ヒドロゲルを介して送達された蛍光標識細胞は、管腔を横切ってより均一に接着したままであった。細胞生存率研究は、生存率が細胞送達手順の影響を受けないことを実証し、細胞の90%以上が生存可能なままであった。
脱上皮化プロセスで洗剤の薄膜を作成し、ヒドロゲルを細胞の送達ビヒクルとして使用することは、このプロトコルの成功に不可欠なステップです。私たちの次の研究目標は、実験室で増殖させた気道一次細胞または幹細胞を脱上皮化気道組織に移植し、機能的な気道組織を調製できるかどうかを調べることです。
