骨格構造の不均一性は、軟骨や骨の発達における遺伝子発現の研究における1つの障害である。このプロトコルは、隣接する組織の正確な分離方法を提供します。後の分析のために高いRNA完全性を維持することにより、これらの組織を正確に収集するために、クレシルバイオレット染色を用いて軟骨および骨のレーザー捕捉マイクロディシスを最適化します。
他の組織は、クレシルバイオレットが標的組織の十分な区別を提供し、RNAの品質が我々の処理方法の後に高いままであれば単離することができる。このような組織には、頭蓋顔面縫合と脳が含まれます。クライオセクションングは、このプロトコルの中で最も要求の厳しいスキルです。
RNAの最高の完全性を維持するために、組織が迅速に解剖され、埋め込まれていることを確認してください。この手順を開始するには、目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度化合物を使用して使い捨て型にサンプルを埋め込み、試料の向きを先端または針で調整します。
サンプルをドライアイスとメチル-2-ブテン浴で迅速に凍結します。次に、ドライアイスを含む蓋付き容器を、ドライアイスにアルミ箔を置き、凍結切断時に解剖サンプルスライドを一時的に保存します。新鮮な凍結標本をドライアイスのバケツに移します。
最適な切断温度化合物の層をクライオスタットの標本ホルダーに置き、すぐに穏やかな圧力で最適な切断温度化合物の上に標本を置きます。最適な切断温度化合物が完全に凍結したら、ホルダーに試料を付けて、クライオスタットの切断アームに固定します。サンプルをクライオスタットに15分間放置し、切断温度に平衡させます。
その後、12マイクロメートルの厚さで組織を切り離し、PEN膜スライド上のスライスを収集します。膜上の連続したセクションを整列します。スライドが完了したら、セクションを数分間乾燥させ、必要なすべてのスライドが収集されるまでドライアイス容器のホイルにスライドを移します。
スライドボックスにマイナス80°Cでスライドを保存します。まず、ラベル付けされた3本の15ミリリットル遠心分離管を用意します。各チューブに80%エタノールの45ミリリットルを加えます。
氷の上に3本のチューブを置きます。95%エタノールの45ミリリットルを含むチューブと氷の上に100%エタノールを含むチューブを置きます。次に、室温で50ミリリットルの遠心分離管に45ミリリットルのキシレンを加えます。
PEN膜スライドを手袋をした手に当てはめて短時間解凍し、80%エタノールを含む各チューブに30秒間2回洗浄し、最適な切削温度化合物を除去します。次に、スライドをアルミニウム箔のシートの上に置きます。ピペット8ミリリットルの1%クレシルバイオレットと50%エタノールをスライドに、30秒間染色します。
80%エタノールを含む第3のチューブでスライドを30秒間洗浄します。95%エタノールを含むチューブを30秒間通してスライドを脱水し、100%エタノールを含むチューブを30秒間、最後に、キシレンを含むチューブを30秒間行う。この後、スライドを繊細なタスクワイパーに5分間置き、キシレンを排水し、セクションを乾燥させます。
まず、レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡、レーザー、およびコンピュータをオンにします。コンピュータにログオンし、ソフトウェアを起動します。緑色のライトが点灯したら、赤いボタンを押してレーザーを有効にします。
ライトが赤く変わると、レーザーを使用する準備が整います。5 ミリリットル PCR チューブのキャップをコレクターに挿入します。ピペット50マイクロリットルの抽出バッファーをキャップに入れ、収集装置を顕微鏡に挿入します。
[コレクター デバイスの変更]ウィンドウで、[参照点に移動]ボタンをクリックして、コレクターを参照点に移動します。フォーカスを調整して、参照点を明確に表示します。次に、ツールバーの左のアンロードボタンをクリックして、スライドホルダを下げます。
下向きの組織セクションを持つホルダーにスライドを置き、ホルダーをステージに戻します。変更標本ウィンドウで[続行]をクリックします。レーザーパラメータを設定するには、レーザーメニューの制御オプションを選択するか、レーザーアイコンをクリックします。
必要に応じて、次のパラメータを調整し、レーザーのパワーであるパワー、レーザーの幅である絞り、およびドローとカットモードの切断速度である速度を調整します。5Xの目的から始め、関心のある分野を見つけ、関心のある分野を最もよく示す目的に切り替えます。コレクターでマークをクリックして、収集するチューブを選択し、移動を選択し、カットまたはカットを行います。
切断が完了すると、PEN膜を有する標的組織は重力によってコレクション管のキャップに落ちる。必要に応じて、この選択と切断プロセスを繰り返して、複数の対象領域をプルします。この後、コレクタをアンロードし、PCRチューブを慎重に閉じます。
マイクロディセックした組織をドライアイスの上に置きます。マイクロディセックした組織を室温で解凍し、次に遠心分離機を短時間解凍し、サンプルを摂氏42度で30分間インキュベートします。この後、5ミリリットルPCRチューブに分解液を回転させます。
メーカーの指示に従って、RNA分離キットを使用してDNase処理とRNA抽出を行います。本研究では、軟骨および骨の微細切除を最適化したレーザーキャプチャーが行われ、その後の分析のために高いRNA完全性を維持しながら、軟骨および骨を正確に組織採取するために視覚化する迅速な手順におけるクレシルバイオレット染色の使用を強調した。スライドの観察は、検査されたすべての軟骨が染色されたマゼンタであり、すべての鉱物化された組織が茶色または黒色に染色されていることを示しています。
軟骨と骨の両方が複数の解剖学的部位で他の組織と容易に区別される。メッケルの軟骨、顆軟骨、下顎骨領域は、レーザー捕捉マイクロディセクショネによって選択され、単離される。シーケンシングに十分なRNAを得るために、メッケルの軟骨の10領域、顆軟骨の10領域、または下顎骨の4つの領域をそれぞれ3つの個別の採取管に引き出す。
RNAを抽出し、全体のRNAをバイオアナライザを用いて分析します。このレーザーキャプチャマイクロディスセクションプロトコルは、異なる発達段階で様々な組織に使用され、RNA完全性数測定は、高いRNA品質を示しています。次いで、遺伝子発現の微分解析が行われる。
下顎骨とメッケル軟骨の間には4,006個の遺伝子が有意に異なって発現している。骨芽細胞または骨細胞に特異的な遺伝子は下顎骨骨でより高く発現され、軟骨細胞特異的遺伝子はメッケルの軟骨でより高く発現する。さらに、破骨細胞マーカーは下顎骨においてより高く発現し、標的組織の分離に成功したことを示す。
この手順に従って、qPCRおよびRNA-seqを含む遺伝子発現解析を行うことができる。これらの方法は、異種組織内の特定の組織または関心のある領域におけるトランスクリプトームの遺伝子発現を解析することができる。
