この技術は、ほとんどの実験室環境で一般的に見られる機器を使用し、同時にいくつかのサンプルの分析を可能にします。この方法は、脂質代謝酵素が細胞の文脈および異なる遺伝的背景でどのように調節されるかについての重要な洞察を提供することができる。酵母培養プレートからコロニーを2%デキストロースを含むSC培地20ミリリットルに接種し、200rpmで一晩振ると摂氏30度でインキュベートする。
翌日、培養液を50ミリリットルの新鮮な培地で0.2の最終ODに希釈し、定常相に達するまで24時間培養します。各サンプルに対して20ミリリットルのクエンチンジバッファーを2つ用意し、マイナス80°Cで保存します。同時に、1ミリリットル当たり10マイクロキュリーの最終濃度でデキストロースフリーSC培地に酢酸ナトリウム塩を添加して放射性標識媒体を調製する。
4,100xgで10分間遠心分離して細胞を回収する。上清を取り除き、20ミリリットルのデキストロースフリーSC培地で細胞ペレットを1回洗います。5分間4,100xgで遠心分離機を行い、デキストロスフリー培地を用いて標識された2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移して細胞を回収します。
さらに2分間細胞を遠心分離します。デキストロースフリーSC培地の500マイクロリットルで細胞を再懸濁し、各細胞懸濁液に500マイクロリットルの放射性標識媒体を素早く添加して、放射標識期間を開始する。回転インキュベーターでチューブを摂氏30度で20分間インキュベートします。
一方、50ミリリットルの円錐管をマイナス10°Cに装備した遠心分離機を予め冷却し、焼入れバッファーの1つの20ミリリットルのアリコートを解凍します。放射標識期間が終了したら、ピペットを使用して、1ミリリットルのサンプル全体を氷上の解凍された消光バッファーに突っ込みます。5,000 x g で冷却した遠心分離機を 3 分間回転させて細胞ペレットを回収し、20 ミリリットルの新鮮な冷急冷バッファーを加えます。
渦を振ってサンプルを振って完全に焼入れバッファーに再懸濁し、再び遠心分離して細胞を収集します。細胞がペレット化されたら、上清を注ぎ出し、ピペットで余分なものを取り除くことによって、サンプルからすべての焼入れバッファーを完全に除去します。さらに処理するためにマイナス80°Cでチューブを保管してください。
各サンプルの酸洗浄ガラスビーズの0.3グラムの重量を量り、氷の上の2ミリリットルマイクロ遠心チューブに保管してください。マイナス80度冷凍庫から細胞ペレットを取り出し、氷の上に置きます。次に、各サンプルに350マイクロリットルのメタノールと700マイクロリットルのクロロホルムを加え、細胞を再懸濁します。
あらかじめ計量したガラスビーズを含むマイクロ遠心チューブに移します。1分間3回、攪拌の間の氷の上に30秒のインキュベーションを行い、細胞を1分間3回渦液化する。細胞を15ミリリットルのガラス遠心分離管に注ぎ、チューブA.マイクロ遠心チューブを1ミリリットルのメタノールで洗い、ボルテックスし、メタノールをチューブAに注ぎ、400マイクロリットルのクロロホルムを加え、その後400マイクロリットルの水をチューブAに加え、最終サンプル量4.45ミリリットルの最終サンプル量をチューブAにします。
1分間の渦のサンプルの後に1000 x gで5分間の遠心分離を行い、界面に横たわる細胞デブリで水相と有機相を明確に分離します。ガラスの牧草地のピペットを使用して、有機相をBとラベル付けした新しいガラス遠心分離管に集め、塩化モルカリウム1ミリリットルを加えます。1ミリリットルのメタノールと2ミリリットルのクロロホルムをチューブAに加え、ボルテックスと遠心分離のステップを繰り返します。
ボルテックスと遠心管Bは、水相と有機相を分離する。上層水層を取り除き、底の有機層全体を4ミリリットルのガラスバイアルに集めます。不活性ガスで乾燥することにより脂質抽出物から溶媒を完全に蒸発させ、オーブンを145°Cに予熱してTLCプレートを加熱します。
TLCプレートにロードする前に、細胞によって取り込まれた放射ラベルの相対的な量を決定します。クロロホルムとメタノールの40~50マイクロリットルでサンプル脂質を再構成し、5分間ボルテックスで1対1の比率で混合した。ガラスの段階的なシリンダーで移動相溶媒の101ミリリットルを調製します。
次に、20%20 TLC飽和パッドとタイトな蓋を含むガラスTLCチャンバーに溶剤を注ぎます。20×20シリカゲル60Gプレートをチャネリングし、鉛筆を使用してプレートの底面の1.5センチメートル上のラインをマークします。プレートが十分に加熱され、TLC飽和パッドが溶剤で飽和したら、オーブンからTLCプレートを取り出し、すぐにそれをロードするに進みます。
ピペットを使用して、TLCプレートの底面から1.5センチメートル上に位置する各レーンの原点に5マイクロリットルのサンプルをスポットし、サンプルの20〜40マイクロリットルまで繰り返し負荷が各レーンにロードされています。標準とサンプルがロードされたら、現像室にプレートを置き、溶剤がプレートの上部に到達するまで待ちます。プレートが完全に開発されたら、チャンバーから取り出し、フュームフードで20分間乾燥させます。
プレートを乾燥させた後、プラスチックフィルムで覆い、自動ラジオグラフィースクリーン付きの現像カセットに入れます。現像カセットからスクリーンを取り出し、それを蛍光体イメージャーの中に置きます。TLCプレートにp-アニアルデヒド試薬をスプレーし、シリカが飽和するまで145度のオーブンで5分間、またはバンドが現れるまで焼きます。
脂質種を定量するには、個々の脂質種を含むシリカゲルを削り取り、それらをガラスシンチレーションバイアルに移します。シリカバンドが小片に減るまで、6ミリリットルのシンチレーション液と渦を激しく加えます。シンチレーションバイアルを備えたラックをシンチレーションカウンターに置き、カウント時間をバイアルあたり2分に調整してカウントします。
蛍光体イメージングは、ラベルフリー脂肪酸、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、コレステロール、スクワランのオートラジオグラムの可視化を可能にします。この方法では精製脂質種を分離し、続いてP-アニアルデヒド試薬をTLCプレートにスプレーして可視化できることが実証された。可視化された種は、滅菌エステルに加えて、これまでに述べたすべての脂質を含む。
パルスに続くラジオラベルフリーメディアに10分間の追跡期間を適用することにより、スクワランの主要プールで観察され、総コレステロールが上昇した。同様に、チェイス期間におけるジアシルグリセロールの出現は、遊離脂肪酸シグナルの減少と相関していた。完全なプロトコルを実行する前に、細胞が目的の成長条件および遺伝的背景において酢酸放射性標識を取り込むかどうかを決定することが重要である。
