そこで我々のモデルは、一次培養中の肺胞上皮細胞における特定の転写産物の転写後調節とその生理学的および病的生理学的状態の研究を可能にする。したがって、原発性肺胞上皮細胞の一過性トランスフェクションは、細胞生理学および代謝に対する影響を最小限に抑え、転写阻害剤を使用した古典的なプロトコルよりも明確な利点をもたらす。目的の遺伝子を発現する応答プラスミドの生成については、その遺伝子の配列、および誘導可能ベクターの複数のクローニング部位を分析して、遺伝子内に存在しない複数のクローニング部位の認識配列を同定する必要がある。
高忠実度のtaqポリメラーゼおよび標準的なオーバーラップPCR技術を使用して、デザイナープライマーを使用して2つの選択された制限酵素認識部位で目的の遺伝子を横取りする。対象となる遺伝子のV5エピトープ上流をコード化する配列は、遺伝子の発現と内在性発現を区別するために含まれなければならない。変異体は、連続的な欠失によって生成され、未翻訳領域の3つの素端を徐々に削除するポリアデニル化部位をコードするリバースプライマーを用いて遺伝子のmRNAの安定性に対する異なる3つの素数未翻訳領域の影響を研究することができる。
最終的には、対象遺伝子の挿入は制限分析によって確認できる。rtPCR中に導入される可能性のある遺伝子の向きおよび変異の欠如は、シーケンシングによって確認することができる。原発ラット肺型2つの肺胞上皮細胞のトランスフェクションのために、完全な最小必須培地の存在下で100ミリメートルペトリ皿で10〜6平方センチメートルの細胞を1回10〜6番目の細胞に播種する。
湿度の5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間培養。翌日、新しい12ウェルプレートの各ウェルに抗生物質なしで完全な培地の500マイクロリットルを追加し、30分間摂氏37度でプレートを予熱します。このインキュベーション中に、応答プラスミドのマイクログラムを1マイクログラム、1マイクログラムの調節ベクトルをウェルあたり1.5ミリリットルチューブに加えます。
カルシウムやマグネシウムを含まない37°CPBSのウェルあたり10ミリリットルで肺胞上皮細胞を洗浄し、細胞培養インキュベーターで摂氏37度のウェルあたり5ミリリットルで細胞を処理します。細胞が剥離したら、抗生物質なしで完全な培地の井戸あたり10ミリリットルでトリプシンを中和し、新しい50ミリリットルのチューブに細胞を収集します。新鮮な培地の4ミリリットルで皿を洗い、残りの細胞を収集し、遠心分離によって細胞を沈めます。
細胞をカウントし、遠心分離するためにPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。ペレットを再懸濁バッファーのミリリットル当たり4倍の密度で10倍から7番目の細胞に再懸濁し、プラスミドおよびベクターの各チューブに5番目の細胞に4倍10を加え、穏やかな混合を行います。エレクトロポレーション装置にチューブを1つ入れ、電解バッファーの3.5ミリリットルでチューブを充填します。
ピストンを完全に押し込んで、金めっき電極チップをピペットに挿入し、チューブの内容物を軽く混ぜます。ピペットで細胞を慎重に吸引し、クリック音が聞こえるまでピペットをエレクトロポレーションステーションに挿入します。肺胞上皮細胞に適したエレクトロポレーションプロトコルを選択し、タッチスクリーン上でStartを押します。
トランスフェクションの直後に、ピペットを取り出し、予め温めた12ウェルプレートの1つのウェルに細胞を移します。すべての細胞が電気ポレートされ、メッキされたら、プレートを細胞培養インキュベーターに入れ、2日後に完全な培地で各ウェルの上清を置き換える。トランスフェクションの成功は、制御ベクターを用いた蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで観察されるEGFPの発現によって確認できる。
関心のある遺伝子の転写を阻害するために、トランスフェクション後72時間は、新たに調製されたアドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムで補った完全な培地のウェルあたり1ミリリットルで上清を置き換える。目的の遺伝子のmRNA半減期を評価するために、プレートを細胞培養インキュベーターに15分から6時間戻す。1ミリリットルの氷冷PBSで1つよく洗浄してから、市販のフェノールクロロホルムRNA抽出キットから500マイクロリットルの溶菌バッファーで細胞を溶かし、各実験時間で穏やかな揺れを行う。
次に、キットの指示に従ってRNAを分離し、230、260、および280ナノメートルで分光光度法によってRNAの収量と純度を決定します。単離されたRNAの安定性を決定するために、まず、各サンプルから全RNAの1マイクログラムをRNaseフリーDNase 1で処理し、プラスミドDNAの痕跡を除去します。市販のcDNA合成キットをオリゴdTとランダムヘキソマープライマーのブレンドで使用して逆転転写効率を向上させ、メーカーの指示に従ってDNA枯渇した総RNAをcDNAに逆転転写します。
180マイクロリットルの分子生物学グレードの水を反応ミックスの20マイクロリットルに加え、cDNA反応をマイクロリットル当たり5ナノグラムで希釈し、新鮮な分子生物学グレードの水でcDNAミックスをすぐに希釈して、マイクロリットル濃度あたり1.25ナノグラムに達します。5マイクロリットルのサイバーグリーン染料マスターミックスを0.1マイクロリットルの分子生物学グレードの水、0.45マイクロモルフォワードプライマーの0.45マイクロリットル、7.5マイクロモルリバースプライマーの0.45マイクロリットル、およびcDNAのマイクロリットル当たり1.25マイクログラムの4マイクロリットルを組み合わせて、10マイクロリットルの総反応量を得る。サンプルをqPCRサーモサイクラーに入れ、示されたqPCR条件を使用して目的のV5タグ遺伝子およびテトロサイクリントランスアクティベーターアドバンスアンプリコンを増幅し、高分解能融解曲線を生成して、所望のアンプリコンの特定の溶融温度を評価し、ノイズアンプリコンピークがないことを確認します。
このピペットエレクトロポレーション技術は、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって検出されたEGFP細胞の比率によって観察される25〜30%のトランスフェクション効率率を促進する。ドキシサイクリンの1ミリリットル当たり1マイクログラムの肺胞上皮細胞の治療は、治療期間中の任意の時点で内因性αENaC mRNAの発現に有意な影響を及ぼさない。実証したように転写制御プラスミド発現系を用いて、V5αENaCシグナルはテトラサイクリントランスアクティベーターアドバンストシグナルに従って正規化し、二重デルタ定量サイクル法を用いてトランスフェクションの効率を決定することができた。
αENaC mRNAの半減期は、テトラサイクリンオフシステムの存在下でアクチノマイシンDの存在よりも最大7倍短く、アクチノマイシンDがアーティファリファαENaC mRNA安定化につながることを確認する。また、シクロヘキサミド及び腫瘍壊死因子α治療は転写物の安定性を著しく低下させるが、リポ多糖類は低下しない。V5 α ENaC mRNA 安定性の変調の有意な変化は、3つの素数未翻訳領域の削除および含まれる領域に応じて誘導され得る。
さらに、特異的RNA結合タンパク質の過剰発現は、空のpcDNA3種のプラスミドを用いたトランスフェクションと比較して、5-α ENaC mRNAの安定性を低下させる。このツールは、肺胞上皮の機能およびその生理学的または病理学的状態に関与する主要遺伝子の転写後の調節に関する新しい洞察を問い合わせるための有用なツールです。
