肝臓は、ヒト膵島の臨床現場での移植のための主要な部位である。マウスの肝内膵島移植は技術的に困難であり、高い割合のマウスが外科的合併症、特に出血で死亡する可能性がある。この研究では、我々が示した2つの方法は両方とも、出血誘発マウスの死を効果的に防止することができる。
我々の手法は、がん細胞、間葉系幹細胞、肝細胞を肝臓に直接注射することで、肝がんなどの肝疾患の研究に応用できます。まず、人間の島文化を穏やかな引っ掻き傷で切り離します。1立方センチメートルのシリンジを使用して、氷上の滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブに300〜350個の膵島を選びます。
すべての膵島がピッキングされたら、チューブを10秒間遠心分離して細胞を沈降させる。ペレットの損失を防ぐために少量の上清を除くすべてを捨て、5%BSAを含む200マイクロリットルHBSSに膵島を再懸濁する。再懸濁した膵島を5ミリリットルのインスリンシリンジにロードし、シリンジの針先を1分間回して、膵島をプランジャーに落ち着かせます。
プランジャーを押し下げて気泡を取り除き、約100〜150マイクロリットルの溶液をシリンジに入れ、穏やかなタッピングでシリンジを反転させて膵島を均等に分配します。ペダル反射に対する反応がないことを確認した後、乾燥を防ぐために目に軟膏を塗布する。麻酔をかけたマウスの腹部を剃って毛皮を取り除き、2%ヨウ素と75%アルコールの3つの交互の拭き取りで手術領域を消毒する。
次に、腹部に1〜1.5センチの切開を行い、腹腔を開く。切開部の周りに滅菌ガーゼを置き、鉗子または綿の先端を使用して腸をガーゼに静かに移します。その後、生理食塩水に浸したガーゼで腸を覆い、門脈を露出させる。
ゲルフォームを使用して膵島移動誘発出血を止めるには、針を斜めにして針を保持し、門脈壁に平行な開口部で針先を位置決めしてから、針を門脈に挿入します。プランジャーを引っ込めて20~50マイクロリットルの血液をシリンジに吸い込み、膵島と混合してから、プランジャーを押し下げたり引っ込めたりしながら、膵島を門脈に注入します。すべての膵島が送達されたら、注射部位の上に約5×5センチメートルのゲルフォームを置く。
綿の先端を使用してゲルフォームを押し下げ、門脈から針を取り除きます。ゲルを所定の位置に約2分間保持し、ゲルフォームを転がして門脈を覆うことを確認します。出血が止まったら、腸を元の位置の腹腔に静かに戻し、500マイクロリットルの暖かい生理食塩水を腹腔に注入する。
縫合糸を使用して筋肉と皮膚の層を閉じます。その後、マウスを加熱パッド上の清潔なケージに入れ、麻酔から完全に回復するまで監視し、12時間ごとに鎮痛剤を投与し、48時間加熱する。脂肪パッドを使用して膵島移動誘発出血を止めるには、実証されているように門脈を露出させた後、2つの綿の先端を使用して露出した静脈を左右に保持し、十二指腸と門脈の間の脂肪組織パッドを見つけます。
門脈に挿入する前に、針先で脂肪パッドを貫通する。実証されているように、膵島を門脈に注入する。すべての膵島が届けられたら、静脈から針を外しながら、綿の先端で脂肪組織を約1分間押します。
その後、腸を腹腔に戻し、実証されているように残りの術後ケア手順を実行します。膵島移植の効果は用量依存的であり、同系膵島移植後30日目に500膵島が転移すると正常な血糖が観察されるが、250膵島が移植されると一過性正常血糖のみが観察され、マウスは移植後10日目までに高血糖に戻る。両方の群で体重の増加が観察され、ヒト膵島を糖尿病性NOD-SCIDマウスに移植すると同一の応答が観察され、膵島等価物の数が多いが、より少ない数ではない場合に正常血糖が観察される。
移入後に出血したマウスの大部分は手術後に死亡するが、出血のないマウスは生存する。移植後28日目に、インスリン染色は、主に血管に近い肝臓全体にヒト膵島が均一に分布していることを明らかにする。インスリンに加えて、フィブリンおよび多形核細胞濾過も移植ヒト膵島内で観察される。
肝内膵島移植は、門脈に大きな穴をあけ、出血を引き起こすことがあります。私たちの2つの改善された手順を使用すると、出血を防ぎ、膵島移植後の死亡率を減らすことができます。門脈内膵島移植モデルは、臨床的ヒト膵島移植を模倣することができる。
私たちの洗練された手順は、レシピエントの生存率を高め、移植後のさらなる膵島機能研究を可能にします。
