この方法により、異なる治療で細菌の通過を測定することにより、ヒトの血液脳関門を解析することが可能になる。細菌性髄膜炎と術後せん妄の病因を発見するのに役立つかもしれません。それは簡単な方法であり、治療の効果は細菌の数によって直接表されます。
これは、内皮細胞上の化合物の高スループット分析を可能にするように改変することができる。生物安全キャビネットに12ウェルプレートを組み立てることから始めます。プレートと各インサートを開梱し、滅菌鉗子を使用してベースのインサートをつかみ、井戸に入れます。
各インサートの多孔質膜に、1マイクロリットルコラーゲンIVとフィブロネクチン混合物あたり10マイクログラムの90マイクロリットルをコーティングし、24時間摂氏37度の細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートします。インキュベーション後、各インサートに1ミリリットルのPBSをピペットし、真空ポンプで吸い込んで、インサートを2回洗浄します。次に、上部および下部のチャンバーにプリウォームDMEM F12培地をピペット処理して膜を平衡化し、37°Cと5%の二酸化炭素でプレートをインキュベートします。
ヒト微小血管内皮細胞を播種し、細胞培養フラスコから培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を完全に覆い、フラスコを摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。5ミリリットルの細胞を15ミリリットルのチューブに移し、培地を含むFCSを5ミリリットル加え、酵素反応を止めます。
210回gで3分間懸濁液を遠心分離し、上清を取り除き、培地5ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。セル懸濁液10マイクロリットルを0.4%トリパンブルー染色の10マイクロリットルに加え、10マイクロリットルの混合物を計数チャンバーに加えます。セルカウンターに計数チャンバーを入れて、カウンターが集中していることを確認する適切なプログラムを開始します。
カウント後、12ウェルプレートの各上層チャンバーに200,000個の細胞を投入し、2~3日ごとに上下チャンバーの培地を14日間摂氏37度でインキュベートします。14日後、細胞の合流率が顕微鏡で画像化して100%であることを確認してください。透水性測定の1日前に、大腸菌株GM2163のコロニーをLB培地の3ミリリットルに入れる。
インキュベーションシェーカーで24時間摂氏37度で細胞を培養します。目的の化合物を含む細胞を処理するには、DMEM F12培地中の最終濃度まで希釈し、この混合物を12ウェルプレートの上下のチャンバーに加え、細胞培養インキュベーターにプレートをインキュベートします。インキュベーション後、抗生物質を含まない培地と完全培地を交換する。
600ナノメートルで光学密度を測定し、50ミリリットルファルコンチューブで0.5のOD600にそれを希釈することによって、一晩細菌培養の濃度を決定します。生物学的安全キャビネットでは、12ウェルプレートの各上部チャンバーに450マイクロリットルの細菌溶液を加え、37°Cで6時間プレートをインキュベートします。インキュベーション後、下側のチャンバから下側の部屋に媒体をこぼさないので、各下の部屋から鉗子とサンプル50マイクロリットルの培地を入れて挿入物を取り外します。
上層室の細菌からの波及が偽陽性の結果をもたらすので、上側と下の部屋の媒体を厳密に分離することが重要である。各サンプルを別々の寒天プレートに落とし、セルスプレッダーで溶液をストリークします。24時間摂氏37度でプレートをインキュベートし、コロニーを数えます。
血液脳関門を通過する微生物に対する糖化の影響を調べるため、細胞を0.5ミリモルグリオキサール溶液で1時間治療し、未治療細胞を対照として作用した。その後、抗AGE抗体による免疫ブロット法を介して糖化を検出した。得られた細菌コロニーをカウントし、絶対的なコロニー数または対照に正規化されたコロニーの相対数として表した。
glyoxalで処理されたサンプルは、治療が細胞バリア密度に影響を及ぼすことを示すコロニーの増加を示した。グルコース誘発タンパク質糖化を調べるため、通常のグルコースおよび高グルコース培地でTHBMECsを栽培しました。対照に正規化されたコロニーの絶対数と相対数は、グルコースが血液脳関門の完全性に有意な影響を及ぼさないことを示した。
処理された内皮細胞は、プロテオミクスアプローチ、例えば質量分析法によってさらに分析され、プロテオームの変化を分析することができる。この技術は、ヒトの血液脳関門および細菌の通過を理解するのに役立つ。老化やアルツハイマー病などの神経変性疾患の側面を発見するために使用することができます。
