当社のプロトコルは、高収率で適切に処理されたKRASの分離と分離を可能にします。本物の遠分化およびカルボキシメチル化KRASの生産は、哺乳類細胞と同様に膜中のKRASを有する実験を行うことを可能にする。プロトコルの高い収率は、前の作業とは一部離れて設定します。
我々は通常、発現物質の1リットル当たり3〜5ミリグラムのタンパク質を精製する。これにより、生物物理学や構造生物学の実験を行うことができます。KRASは、膵臓癌の20%と90%の癌で変異する。
したがって、本物の加工タンパク質を産生するプロトコルを持つことは、実際のタンパク質を癌細胞の膜上にあるように研究できるように、薬物スクリーンを開発するのに非常に有用です。このプロトコルは、細胞内で遠く、完全に処理される他のタンパク質を研究するのにも非常に有用である。したがって, あなたがする必要があるのは、目的のタンパク質とKRASを交換し、バキュロウイルスにそれを入れる.
重要なステップは、カチエーション交換クロマトグラフィーの周りにあるものです。適切なカラムを使用し、タンパク質が低塩バッファーにある時間を制限することは、成功のために不可欠です。降水量がスノーグローブタイプのイベントではないことを理解することは、プロトコルに新しいイベントを導くのに役立ちます。
これは、カチネーション交換列の負荷を複数の小さな負荷に分割する必要性を示すことによって強化されます。細胞をライジングした後、ライセートを明らかにし、標的タンパク質をIMACで精製し、SDSページとクマシー染色を用いてタンパク質画分を分析する。ピーク画分をプールし、摂氏4度でバッファDの2リットルに対して一晩プールを透析します。
翌日、透析からサンプルを取り出し、遠心分離機を4,000回gで10分間遠心分離し、任意の沈殿物を除去します。最終的な透析および明確化されたサンプルは、多くの場合、まだかすんでいるが、それ以上の処理なしでCEXカラムに適用することができます。バッファーGの3つのカラム量でそれを洗浄することによって20ミリリットルのカチオン交換カラムを準備し、次にバッファF.Nextの3列の体積で、20ミリリットルのバッファーEを加えることによって、透析サンプルの20ミリリットルを最終的な塩化ナトリウム濃度100ミリモルに希釈し、交換カラムにサンプルを適用します。
一度にすべてではなく少量のサンプルを希釈することが重要であり、希釈されたサンプルは、タンパク質の沈殿を制限するために希釈直後にカラムに適用する必要があります。前の希釈が荷重の終わりに近づくと、希釈したてのサンプルでカラムをロードし続けます。次に、通常3つのカラム体積を必要とするバッファFでカラムをベースライン吸光度280に洗浄する。
バッファーFから65%緩衝Gまでの400ミリリットルの勾配でカラムからタンパク質を溶出し、6ミリリットル分数で溶離を回収する。勾配が完了したら、65%バッファGの追加の1.5カラムボリュームのカラムを洗浄し続けます。SDSページとクマシーブルー染色分析の両方に基づいて正の分数を選択し、クロマトグラムのUVトレースの検査を行います。その後、タンパク質をプールし、原稿の指示に従ってHis6 TEVプロテアーゼでそれを消化します。
消化と透析の後、1分間に3ミリリットルのバッファーAで平衡化された20ミリリットルのIMACカラムにタンパク質をロードします。このクロマトグラフィー中に7ミリリットル分を収集し、合計3カラムのバッファーAの体積で、またはベースライン吸光度に達するまでカラムを洗浄します。バッファーCの5カラム体積勾配を0%から10%にして標的タンパク質を溶出し、7ミリリットル分を回収する。
次に、SDS ページで正の分数を識別します。SDSページで分析する場合、明確化されたライセートは、融合タンパク質His6-MBP-tev-KRAS4bに対応する約65キロダルトンに移行する暗いバンドを含むべきである。共発現したFNTAbは48キロダルトンに移行する。
精製中のCEXステップは、タンパク質分解の程度を減らし、完全に処理されたタンパク質を豊かにするので重要ですが、プロトコルの中で最も複雑な部分です。このステップの典型的な結果はKRAS4b-FMeの顕著なピーク3を有するが、溶出プロファイルは可変であり得る。ESIMSを用いた無傷の質量分析は、タンパク質の正確な分子量を確認し、それによってファルネシレーションまたはカルボキシメチル化の相対的な割合を確認します。
典型的な最終ロットには検出可能なKRAS4b-FARNが含まれていましたが、この割合はこの分析によるピーク高さの点で15%未満でした。ネイティブ質量分析は、GDPに結合KRAS4bの質量を決定するために使用されました.サンプル溶媒を酢酸アンモニウムと交換し、より柔らかいイオン化を確実にするため、天然複合体はそのまま残ります。
KRAS4b-FMeとリポソームの相互作用を表面プラズモン共鳴で測定し、KRAS4b-FMeが膜に結合するためにはファルネシリ化とカルボキシメチル化が必要であることを検証した。予想通り、KRAS4b-FMeはリポソームに結合し、未処理KRAS4bは結合しなかった。低塩にタンパク質が曝される時間を最小限に抑えることは、収量に影響を与えるプロトコルの唯一の最も重要な側面です。
タンパク質は、バッファーEの希釈後、この低塩濃度で短時間でしかありませんが、タンパク質は、KRASがどの脂質と相互作用するかを調査するためにリポソームやナノディスクのような膜模倣体を使用する様々な生物物理学的実験に使用できます。これらのデータを使用して、KRASが細胞の血漿膜とどのように相互作用するかを推定し始めることができます。今回、我々の研究グループは、KRASのX線結晶構造を、このタンパク質の遠分化およびメチル化形態に特異的なシャペロンと複合体で解くことができた。
