天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

常磁性緩和増強技術は、分子間距離を特徴付けて測定し、一過性および/または人口の少ない生体分子相互作用を定量化するために利用できます。ここでは、この手法を適用して、タンパク質の凝縮に先行する相互作用をキャプチャしました。PREの感度により、他のNMR技術では目に見えず、アクセスできない動的状態の原子分解能の同定、検出、定量が可能になります。

このプロトコルの重要なステップには、非共役ニトロキシドスピン標識の除去と、ピーク高さを正確に測定するためのスペクトルの慎重な分析が含まれます。さらに、NMR実験のセットアップとパルスキャリブレーションの際には注意が必要です。まず、ストック溶液から目的の15N同位体標識タンパク質の20倍モル過剰で3-マレイミド-PROXYLを加えます。

室温または摂氏4度で、光と酸素から保護し、穏やかな揺り動かしまたは栄養補給しながら一晩インキュベートします。翌日、タンパク質サンプルの広範な透析またはゲルろ過を使用して、非特異的溶媒PREを防ぐために、非反応フリースピン標識を除去します。次に、Ellman試薬を使用して、溶液中の遊離スルフヒドリル基を定量します。

マイクロプレートリーダーで吸光度を測定し、検量線を作成します。分子内PREを測定するには、NMRに適したバッファー中で、15N同位体濃縮スピン標識タンパク質を100マイクロモル以上300マイクロモル以下の濃度に調製します。次に、ロングステムガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、NMRサンプルを高磁場磁石での使用に適した5ミリメートルNMRチューブに移します。

サンプルを磁石に入れます。lockコマンドを使用して重水素信号をロックし、施設のプロトコルに従ってプロトンチャネルを調整して一致させます。次に、トップシムサブルーチンを使用してシムを調整し、溶媒シグナル抑制を最適化します。

次に、P-OPTプログラムを使用してプロトンパルスを校正します。次に、標準サンプルに対して15Nパルスを校正します。シェーピングパルスの正しい減衰を決定するには、シェイプツールサブルーチンを使用します。

次に、フォルダアイコンをクリックして、適切なパルス形状ファイルを開きます。成形パルスは、取得パラメータのパルスパラメータセクションにあります。パルス定義ファイルをロードしたら、「波形の解析」、「形状の統合」の順にクリックします。

校正済みのプロトン90度ハードパルス、希望形状パルス長、および回転を入力します。次に、校正された90度パルスの減衰に電力レベルの変化を加えて、成形パルスの電力レベルを計算します。標準プロトン15N HSQCを記録して、掃引幅、キャリア周波数を最適化し、水抑制を確認します。

最後に、SW[SW]コマンドと[TD]コマンドを使用して、または適切なダイアログ ボックスで直接、スイープ幅と間接寸法増分数を調整します。前に示したように、成形パルスを校正します。次に、[集録パラメータ]タブの[パルスパラメータ]セクションに校正済みのパルス長を入力します。

2時間遅延点アプローチを使用してアミドプロトンT2を測定するには、VDリストファイルを編集して時間遅延を設定します。最初の遅延は 0.01 ミリ秒に設定されます。予想される最大PREとの関係を使用して、2番目の遅延を選択します。

次に、第1および第2の遅延スペクトルの第1の増分を比較し、信号がその初期値の40〜50%の間に減衰するように第2の遅延を調整することによって、適切な値を決定する。十分な信号平均化のために、記録する複素点の数とスキャンの数を決定します。次に、コマンドEXPTを使用して実験時間を計算し、コマンドZGで実験を開始します。アスコルビン酸ナトリウムをNMRバッファーに溶解した後、元のNMRバッファーと一致するようにpHを調整します。

次に、チューブの縁の下に液滴を置いて、スピン標識の濃度の10倍を超える過剰モルでアスコルビン酸をNMRチューブに加えます。チューブに蓋をし、慎重に反転させて混ぜます。ハンドクランク遠心分離機で200〜400 Gで10〜20秒間回転させ、チューブの底にサンプルを沈降させます。

チューブをホイルで包んだ後、反応を少なくとも3時間進行させます。次に、常磁性サンプルに使用したのと同じパラメーターを使用して、反磁性サンプルにアミドプロトンT2を記録します。分子内アミドプロトンガンマPREは、RNA結合タンパク質EWSR1の低複雑性ドメインに由来する自己会合性の天然変性断片上に記録されました。

スピンラベル付着点に連続して近接する残基は、大幅に広がることが予想され、スペクトルでは検出できません。付着点から順次間隔を空けているが増強ガンマを示した残基は、スピン標識に空間的に近かった。天然変性タンパク質の場合、ピューレを記録および分析すると、分子内接触および一過性相互作用表面に関する情報が得られます。

PRE測定を動的光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、計算方法などの他の生物物理学的方法と組み合わせることで、より深い洞察を得ることができます。PRE測定は、過渡的な人口の少ない状態を特徴付けるのに役立ちます。このアプローチは、分子認識、アロステリック立体配座選択、相分離による膜のないオルガネラの組み立てを含むアセンブリプロセスなど、無数の生物学的プロセスに重要な相互作用を特徴付けるために拡張できます。