このプロトコルは、患者自身の多血小板血漿と5分間の標準化された調製物を用いたヒト線維芽細胞培養用の自家システムです。PRPは、培養中の線維芽細胞の大規模な細胞増殖を促進します。自家細胞療法のために大規模なクリークと安全な細胞増殖が必要な場合は、PRPを細胞サプリメントとして使用するこの方法を使用することをお勧めします。
このプロトコルを試すときは、PRPの整合性を確認することをお勧めします。あなたの血漿は赤血球がなくて非常にきれいでなければなりません。あなたがそれを転送するとき、あなたはそれを非常に慎重にしなければなりません。
そして、あなたの組織の消化に関しては、先に進む前にそれは非常にきれいでなければなりません。まず、血液で満たされた多血小板血漿(PRP)チューブを慎重に逆さまにして、血液を抗凝固剤と混合します。血液サンプルを1500gで45度の固定ローターで5分間遠心分離し、チューブのバランスを取ります。
遠心分離後、分画された血液は、分離ゲルの下に閉じ込められた赤血球と白血球、およびゲルの表面に血小板を有する。PRPチューブを20回静かに反転させて、血漿上清中の血小板沈着物を再懸濁します。血小板がゲルから完全に剥離し、血漿が透明で透明から濁った状態に変化することを確認します。
10ミリリットルのシリンジに接続された移送装置を使用してチューブから血漿溶液を採取する。皮膚サンプルをPBSを含む50ミリリットルのポリプロピレンチューブに入れ、チューブを静かに振ってください。皮膚サンプルが比較的多い場合は、表皮側を下にして150平方センチメートルの組織培養皿の蓋に置きます。
鉗子とはさみを使用して皮下脂肪組織を取り除きます。組織が乾燥するのを防ぐために、PBSで数分ごとに組織を洗い流してください。脂肪の除去が完了したら、メスを使用して皮膚サンプルを約0.5 x 1.5センチメートルのストリップにカットします。
次に、5ミリリットルのコラゲナーゼ/ディスパーゼミックスを滅菌15ミリリットルのチューブに加えます。切断した組織をチューブに移します。組織片が溶液に沈んでいることを確認し、チューブをしっかりとキャップします。
チューブを摂氏37度のインキュベーターに入れ、軌道を150分間振とうします。インキュベーション後、組織を含むチューブをバイオセーフティキャビネットに移動します。滅菌済みの100ミリメートル培養皿の蓋を逆さまにしてバイオセーフティキャビネットに入れます。
組織懸濁液を飛散せずに100ミリメートル培養皿の底に移す。チューブ内に組織片が残っている場合は、滅菌1ミリリットルピペットまたは滅菌鉗子を使用して、培養皿の底に組織片を移します。表皮を上に向けて、鉗子で真皮を持ちます。
別の鉗子で表皮の端をつかみ、真皮と表皮をはがします。分離した片を同じ蓋の上に保ち、PBSを含む新しい100ミリメートル培養皿に真皮片を置きます。次に、実験室用鉗子を使用して、真皮片を3ミリリットルの0.3%トリプシンPBSを含む15ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。
チューブを摂氏37度の水浴でインキュベートし、チューブを数回反転させて2〜3分ごとに内容物を混合します。10〜20分後、3〜5ミリリットルの氷冷完全増殖培地を加えて反応を停止します。チューブを数回激しく渦巻きます。
線維芽細胞を含む懸濁液を85ミクロンのナイロンメッシュを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。線維芽細胞溶液を150gで10分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを100〜200マイクロリットルの完全増殖培地に再懸濁して細胞数を測定します。
細胞を25平方センチメートルの組織培養フラスコにプレートします。次に、フラスコを摂氏37度でインキュベートします。非接着細胞を含む培地は翌日に交換し、3〜4日ごとに交換します。
線維芽細胞が70〜80%コンフルエントに達したら、PBSで洗浄し、トリプシン-EDTA溶液を追加します。フラスコを摂氏37度で3分間インキュベートした後、3〜5ミリリットルの温かい完全増殖培地を加えて反応を停止します。その後、細胞懸濁液を200gで5分間遠心分離する。
吸引により上清を除去する。線維芽細胞をPRP培地で培養し、摂氏37度でインキュベートします。推奨される最小細胞密度は、平方センチメートルあたり4, 000生細胞です。
専用の医療機器を使用して、10人の異なる患者の全血を処理することによりPRPを作成しました。この装置は、赤血球と白血球の大部分を除去しました。PRPの平均血小板濃度は、全血中の血小板濃度よりも約50%高かった。
自家線維芽細胞は、10%FBSを含む培地または1〜50%の範囲のPRP濃度の培地で培養し、7日間の培養後、培地を変更せずに、20%PRPでプライミングした培養物は、より多くの生存線維芽細胞を示した。PRPは、FBSと比較して最大7.7倍の増殖ブースターとして強力な効果を示しました。ファロイジン染色は、PRP活性化時に観察される形態変化が、線維芽細胞活性化の特徴であるF-アクチン再編成に関連していることを示しました。
急速な細胞増殖の主な懸念は、ゲノム改変のリスクです。これを評価するために、比較ゲノムハイブリダイゼーションアッセイを実行して、細胞のゲノム安定性を評価できます。この技術の主な利点は、FBSをより強力な自家生物学的サプリメントであるPRPに置き換えることです。
これにより、研究者は異種物質を添加することなく、より多くの細胞をより速く成長させることができます。この技術は、臨床適用前にex vivoでの増殖を必要とする他の細胞タイプ、例えばケラチノサイトまたは間葉系幹細胞に使用する可能性があります。
