この方法は、研究者がシンプルで効果的な領域ベースの分析を使用して細胞の共培養を分析し、カウントするのに役立ちます。この技術は、広く利用可能なソフトウェアを使用して比較的簡単に実装でき、共存環境内でさまざまな細胞型を識別するための信頼性が高く正確な手段を提供します。この方法は、細胞の特定の共培養がどのように相乗効果を発揮して組織再生を助けるかについての洞察を提供することができる。
この方法は、単一培養バイオマーカー研究を検証するためにも採用することができる。まず、FBS、ペニシリン-ストレプトマイシン、炭酸水素ナトリウム、およびβ-メルカプトエタノールを添加した1ミリリットルのDMEMで、生の264.7マクロファージを摂氏37度および5%二酸化炭素で培養し、5ミリリットルの細胞培養フラスコ内で、1センチメートル平方キロメートルの密度で25,000細胞。10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM中のNIH/3T3細胞を培養する。
共培養イメージングでは、生264.7マクロファージとNIH/3T3線維芽細胞を、生264.7培地とNIH/3T3培地を1部ずつ含む共存培地を用いて、様々な比率で、総密度25,000細胞/センチメートル平方メートルで培養した。播種後、細胞を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートして、80%細胞コンフルエントの生存細胞密度に達する。40X対物レンズを搭載した倒立顕微鏡を使用して細胞画像を取得するには、さまざまな画質の画像を正確に評価するアルゴリズムの能力を決定します。
非球根画像と球根画像の両方を生成するさまざまな病巣を持つグレースケールの画像を取得し、生のcziファイルにエクスポートします。領域ベースの方法を使用してセルの画像を取得するには、解析用の画像ファイルをコピーしてビンに貼り付け、コマンドを実行してファイル名を入力します。[ファイル名を指定して実行] を押してプログラムを起動します。
再構成によって開き、続いてソース関数を使用して再構成して閉じることによって画像を解析し、それぞれのコマンドを実行して背景から前景を拡大します。百分位数ベースの識別システムを利用して再構成された画像を二値化するために、所与の画像の少なくとも0.5%を含む最大のピクセル値を有する最大関連ピクセルからの百分位差を用いて、背景から細胞を区別する。生の 264.7 マクロファージのピクセル値を分析および評価し、値が関連する最大ピクセルの 4.5% 以内であることを確認します。
次に、ピクセルをセルラーとしてマークします。球根細胞プロファイルを含む画像の場合、反復手順を実装して、細胞の中心での誤った二値化を補正します。セルの総カバレッジの初期推定値を決定します。
アルゴリズムを実行し、アルファとカッパの初期推定値を使用して画像を分析し、島の一部を埋めます。次に、分析後のセル数とカバレッジを使用して、κを再計算します。画像の二値化後の平均セル面積を求めるには、コマンドを実行して画像内で見つかったすべての中心位置と円の半径のベクトルを取得します。
半径出力を使用して、平均化して平均セル面積を計算し、少なくとも 10 個のセルを分析して、正確な面積識別を保証します。前述のコマンドを使用して、画像解析を実行します。次に、生の264.7細胞とNIH/3T3細胞の画像を用いてパラメータφを実験的に決定することにより、生の264.7細胞とNIH/3T3細胞を含む共培養物の解析を行います。
最初の phi 値を推測し、セル数とカバレッジが生の 264.7 および NIH/3T3 共培養に固有の手動カウントと密接に一致するまで繰り返します。単一培養画像について前述のように、総細胞カバレッジで生の264.7細胞数を決定します。φパラメータなしで流域変換画像を再度解析し、マクロファージと線維芽細胞の両方を検出します。
前述の標準的な閾値化および面積ベースの定量化方法を使用して得られた生の264.7細胞ピクセルを選択的に減算することによって、NIH/3T3線維芽細胞データを取得します。非球根生264.7マクロファージの分析を行い、アルゴリズム出力を記録した。アルゴリズムを用いた画像の平均面積計算では226個の細胞がカウントされ、手動カウントでは6%のおおよその誤差値で241個の細胞が同定され、球根生264.7個のマクロファージの分析も行われた。
アルゴリズムを用いた画像の平均面積計算は221細胞を計数し、252細胞の手動カウントで検証し、おおよその誤差値は12%で、生の264.7マクロファージとNIH/3T3線維芽細胞の両方を含む共培養の分析を行った。生の264.7マクロファージ数のアルゴリズム出力は137であったが、手動カウントは11%のおおよその誤差値で155個の細胞を同定した細胞計数アルゴリズムの堅牢性を決定するために、5つの生の264.7マクロファージ画像を自動細胞識別および手動ユーザーカウントによってカウントした。サイコロ係数は、5つの画像にわたって0.85の平均パラメータで得られました。
このプロトコルの重要なステップは、単一培養および共培養画像の両方で堅牢な細胞検出を可能にする百分位数ベースのパラメータの使用です。このプロトコルは、分子生物学技術を使用してさらなる分析のために目的の細胞を同定し、特定の細胞集団および共存系におけるバイオマーカーの発生を定義するバイオマーカーを評価するために使用することができる。
