このプロトコルは、標的タンパク質のグリコプロファイルに対する複数のグリコシル化酵素の効果をスクリーニングするために利用され、酵素の機能性のよりよい理解に貢献することができる。このプロトコールの性質により、グリコシル化酵素を一過性でありながらハイスループットな方法でスクリーニングすることができます。グリコシル化プロファイルの変化は、抗体活性の改善につながり、したがって最終生成物の有効性を高めることができる。
バイオ製薬企業は、重要な品質属性としてグリコシル化を注意深く監視しています。異常なグリコシル化は、癌のような疾患の特徴である。したがって、この方法は薬理学的および生物医学的研究に関連する。
このプロトコルは、哺乳類細胞トランスフェクションやウェスタンブロットを含むいくつかの実験技術の経験があることを前提としています。最初のインスタンスでは、より少ないサンプルから開始し、停止点を使用することをお勧めします。チャイニーズハムスター卵巣細胞の密度と生存率を評価することから始めます。
その後、汚染を避けるために、バイオセーフティキャビネットとすべての機器を70%エタノールとRNase阻害剤溶液で慎重に清掃します。次に、細胞を100倍Gで5分間ペレット化し、1ミリリットル当たり6個の細胞に対して10倍から5倍の細胞密度で予め加温した培地にそれらを再懸濁する。8マイクロリットルのDsiRNAマスターミックスまたはコントロールを滅菌エレクトロポレーションキュベットに移す。
800マイクロリットルの細胞懸濁液を同じキュベットに加え、混合し、エレクトロポレーションパルスを送達する。次いで、細胞懸濁液をキュベットから6ウェルプレートの1ウェルに移し、泡状物質を避ける。細胞を振とうせずに10分間インキュベートする。
インキュベーション後、800マイクロリットルの予め加温した培地を加えて、ウェルあたり1.6ミリリットルの最終容量を作る。トランスフェクトした細胞をインキュベーター内で150RPMで振とうしながら増殖させる。48時間後、上清および細胞を回収する。
IgG精製後、溶出Aを分画分子量3キロダルトン遠心濃縮機に加え、4°Cで40~50分間、Gを13,300回で遠心分離した。遠心分離は、残留体積が50マイクロリットル以下になると完了する。フロースルーを破棄し、500マイクロリットルの予め冷却した1X PBSを加えて、残留上清を希釈する。
50マイクロリットルの残留上清が残るまで同じ条件を用いて試料を再度遠心分離する。上清の100倍希釈液を得るために、予め冷却した1X PBSを500マイクロリットル加え、遠心分離工程を繰り返す。上清を40マイクロリットルで1リットルあたり約2.5グラムの終濃度に濃縮し、グリカン分析法との適合性を確保します。
グリカン分析のために、200マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を2ミリリットルPCRチューブに移す。磁気スタンドの上に置き、ビーズを上澄み液から分離し、上澄み液を慎重に取り除きます。その後、磁気スタンドからチューブを取り出し、精製タンパク質サンプルとボルテックスを加えます。
次に、供給変性緩衝液をサンプルチューブに加え、摂氏60度で8分間インキュベートする。最適な反応性能を得るために、サンプルチューブを開いたままにしておきます。インキュベーション後、PNGase Fを加え、摂氏60度でさらに20分間インキュベートして、精製抗体からグリカンを切断する。
N-グリカンの放出後、サンプルチューブを閉じ、渦を巻き起こす。次いで、アセトニトリルをサンプル管に加え、ボルテックスし、室温で1分間インキュベートした。サンプルチューブを磁気スタンドに置き、ビーズを溶液から分離します。
その後、ピペットを用いて、ビーズに触れることなく上澄み液を慎重に除去する。蛍光色素含有グリカン標識溶液をヒュームフード内のサンプルに加え、ボルテックス処理により混合する。開いた蓋で摂氏60度で20分間インキュベートした後、サンプルをアセトニトリルで3回洗浄して余分な色素を除去した。
次いで、標識されたグリカンを二重蒸留水に溶出させる。サンプルチューブを磁気スタンドに置き、精製および標識グリカンで富化した上清を回収する。次に、必要なすべての標準とサンプルを準備し、指定されたトレイ位置にロードします。
グリカン分析プロトコルを実行し、適切なソフトウェアを使用してサンプル中に存在するグリカンを分析および同定します。ウェスタンブロット分析は、3つのFut8 DsiRNA構築物の混合物でトランスフェクトされた細胞におけるFut8タンパク質発現の減少を示した。ノックダウン細胞由来のグリカン構造も、フコシル化の減少を示した。
この傾向は、アガラクトシル化構造において最も顕著であり、ガラクトシル化構造においてより少ない程度で観察された。2つの方形波パルスを用いたエレクトロポレーションからコアフコシル化の2倍の減少が観察されたが、細胞生存率に大きな差はない単一の方形波パルスと比較して観察された。全体として、短い干渉RNA濃度の増加は、収穫時間を増加させるよりもコアフコシル化に大きな干渉を有する。
水とアセトニトリルの比率は、グリカンが溶液中またはビーズの一部にあるかどうかを決定します。これは、溶液から標識されたグリカンが誤って除去されるのを避けるために、洗浄ステップ中に覚えておくことが重要です。フォローアップ実験には、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性を定量化するための細胞ベースのアッセイを用いた精製モノクローナル抗体の特性評価が含まれる可能性がある。
