患者由来の腫瘍サンプルの培養方法の改善は、従来の細胞株の使用から離れるにつれて非常に重要です。このプロトコルは、生体内癌モデルとは異なり、高スループットおよび高含有スクリーニングに適したプラットフォームにおける患者由来腫瘍細胞のインビトロ培養を可能にする。PDXを組み込んだプラットフォームは、ネイティブ腫瘍を反映するより異質なシステムを評価することを可能にする。
これは、薬物のメカニズムへの洞察を得ることができ、より速い薬物スクリーニングを可能にする.この方法は、間質、内皮、および免疫細胞の組み込みによって拡張することができる。これらの共同培養は、ネイティブの腫瘍集団と建築をさらに反映している可能性があります。
PDXのようなより貴重な細胞に移行する前に、簡単に拡張された細胞株を持つマイクロ流体プレートをロードする練習。プレート分配中のアライメントは成功に大きな影響を与え、視覚的なデモンストレーションはこの概念を容易に伝えることができます。開始するには、腫瘍組織を前計量された無菌50ミリリットル円錐形チューブに移す。
血液および汚染物質を除去するために30ミリリットルの無菌PBSで6回リンスする。できるだけ多くの液体を取り出し、腫瘍組織を秤量する。腫瘍組織を60ミリメートルの丸い組織培養皿に移し、滅菌カミソリの刃またはメスを使用して1ミリメートルの部分にミンチします。
PDX処理媒体を5ミリリットル加えて、腫瘍スラリーを採取します。5ミリリットルの解離酵素溶液を加えて、腫瘍スラリーを採取する。別の5ミリリットルの解離酵素溶液で培養皿をリンスします。
その後、PDX処理媒体を5ミリリットル加えます。穏やかな揺れで摂氏37度で20分インキュベート。インキュベーション時間の途中で、チューブをそっと旋回します。
インキュベーションの後、ピペットを血清ピペットで穏やかに上下にして塊を分解します。新しい無菌50ミリリットルチューブの上に70ミクロンの細胞ストレーナーを置き、細胞をろ過します。次いで遠心分離機を1,200rpmで2分間ペレットし、細胞をペレット化した。
上清を取り除き、PDX培地を2~3ミリリットルで再懸濁する。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。チップあたりの所望の細胞密度を達成するために必要な PDX 誘導細胞の必要数を推定するには、この表を使用します。
6ウェル組織培養板のウェル当たりPDX培養培地の5ミリリットルの6細胞に1〜2回10を1〜2回プレートする。50~55rpmで穏やかな揺れを伴い、摂氏37度、炭酸ガス5%、湿度95%で48時間インキュベートし、クラスター形成を促進します。クラスターが形成されたら、遠心分離に進みます。
まず、18ミリリットルの密度勾配遠心分離液を無菌50ミリリットルの円錐管に2ミリリットルの無菌10X HBSSSと完全に混合して20ミリリットルの100%の勾配溶液を調製します。滅菌1X HBSSでこの100%溶液を希釈して、それぞれ10ミリリットルの20%30%40%と55%密度勾配溶液を作ります。15ミリリットルの円錐管の底に55%の密度の勾配の溶液の3ミリリットルを加える。
チューブを斜めに保持し、40%密度の勾配溶液の3ミリリットルをチューブの斜め側と55%層の上にゆっくりと分配します。30%の密度勾配解を繰り返します。次に、PDX回転培養物の上清を5ミリリットルの血清ピペットでチューブに集め、プレート表面を穏やかにすすいでください。
遠心分離機を1、200rpmで2分間ペレット細胞にする。上清を取り除き、20%密度の勾配溶液の3ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。慎重に15ミリリットルチューブの勾配の上に細胞と20%の密度の勾配溶液を重ね合う。
チューブと遠心分離機をスイングバケツローター遠心分離機に30分、摂氏4度、2,000倍G、ゼロブレークでキャップします。遠心分離後、分数が表示されます。実行可能なPDX細胞培養は、典型的には40〜55%の密度勾配溶液界面に見られる。
新鮮な15ミリリットルのチューブに各分率の2〜3ミリリットルを収集します。各分数に3〜4巻の無菌1X HBSSを加え、完全に混ぜ合わせるために反転します。遠心分離機をGを1,000回3分間ペレット化し、細胞をペレット化する。
上清を取り除く。PDX処理媒体の1〜2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。50~100マイクロリットルの小さなアリコートをチューブに移し、等量の解離酵素溶液を加え、解離液を取り出します。
クラスター化セル懸濁液のセル数を評価します。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞を数えます。メーカーの指示に従ってヒアルロン酸ヒドロゲル溶液を再構成してください。
マルチチャンネルピペットを使用して、2車線のマイクロ流体プレートの観測ウィンドウ列のすべてのウェルに50マイクロリットルのHBSSを加え、培養湿度と最適なイメージング条件を維持します。所望の細胞密度でヒドロゲルの50マイクロリットルに必要な細胞懸濁液の体積を計算します(例えば、マイクロリットル当たり5,000細胞)。1つのマイクロ流体プレートを播種する場合、計算された体積を4つの無菌1.5ミリリットル遠心分離管のそれぞれにアリクォー。
HAチオール溶液のpHを、使用直前に1種の水酸化ナトリウムで8個に調整します。40マイクロリットルのHAチオールを10マイクロリットルのPEGdAと混合し、時間をかけてゲル化をモニタリングすることにより、試験ゲル化を行います。次に、細胞懸濁液アリコートを200倍Gで2分間遠心し、室温で細胞をペレット化する。
上清を慎重に取り除き、50マイクロリットルの最終体積のために40マイクロリットルのHAチオールで細胞を再懸濁する。HAチオールの細胞の1アリコートに10マイクロリットルのPEGdAを加える。よく混ぜ、マイクロ流体プレートを播種する前に1〜3分待ちます。
1.5マイクロリットルを単一チャネル反復ピペットに塗布するためのチップを貼り付け、HAヒドロゲル溶液中の細胞に負荷を加えます。水素アリコートは、細胞の分布を確実にするためによく混合しておくことを忘れないでください。マイクロ流体プレートをシードするには、ピペットチップをブレードに垂直に位置合わせし、先端をゲル入口の中央にそっと配置して接触を確実にしますが、1.5マイクロリットルのヒドロゲル溶液を分配する際に圧力を加えないようにします。
プレートの上部、プレートの底面、または顕微鏡で見て、マイクロ流体チャネルの充填状況を観察します。この図をガイドとして使用して、荷重を評価します。ロードの1分後、次のアリコートの準備中にプレートを反転させます。
HA溶液中の細胞の残りの3つのアリコートについてマイクロ流体プレートの播種を繰り返します。すべてのチップを充填した後、ゲル化が完了するまで45分間加湿インキュベーターで37°Cでプレートをインキュベートします。その後、提供されたマニュアルを使用して、14度の角度と4分間隔で正しい拡散設定で細胞培養インキュベーターに灌流ロッカーが取り付けられていることを確認してください。
PDX細胞培養培地を50マイクロリットルの培地入口に加えます。プレートを表面にそっとタップして、マイクロ流体チャネルを満たす液体を促します。次に、プレートを反転して、チャンネルが正しく塗りつぶされているかどうかを確認します。
DMEM/F-12を50マイクロリットルのDMEM/F-12に加えます。もし、空気泡が灌流流に閉じ込められている場合は、表面に対してプレートを穏やかに叩いて取り除きます。顕微鏡とプレートレイアウトフォームを使用して、チップ充填の成功を記録します。
不適切に充填されたチップを、さらなる実験的使用から除外する。14度の傾きと4分のサイクルに設定されたチルトロッカーにプレートを置き、灌流を開始します。2日ごとに、PDX培養培地を交換し、最初に入口に50マイクロリットル、次いで出口に50マイクロリットルを入れ替える。
本研究では、プログラム可能な灌流ロッカーを標準的な水ジャケット細胞培養インキュベーターに設置し、2車線のマイクロ流体ブレードを装填用の標準的なバイオセーフティキャビネットに用意した。3Dマイクロ流体PDX培養の生存率および形態は、分離されていない及び密度勾配遠心分離条件の両方で評価した。1日目、分離法を経たそれらの培養物は、分離されていない培養物に比べて10倍少ない単死細胞を示した。
重要なことに、分離されたクラスターは主に生きた細胞で構成されていました。クラスター サイズ分布に対して統計的に有意な差は確認されませんでした。培養液は、マイクロ流体プレート内で7日間さらに維持された。
生細胞の総数は一貫しており、クラスターは培養の寿命にわたって約80%の生存率を保持した。各PDXラインはユニークなので、腫瘍消化の容易さ、クラスターの表向きの大きさと形態、および勾配精製内のクラスターの位置は異なります。この方法を用いて確立されたPDX培養物は、画像またはプレートリーダーベースの生存アッセイ、固定および免疫蛍光標識、または他のプロトコル用の細胞ライセートを収集するために解像してアッセイすることができる。
この方法により、研究者は腫瘍細胞の生物学または薬物反応を探求するために、腫瘍微小環境を再現することができます。ユーザーは、人間由来の組織で作業する前に、標準的な人間の被験者のトレーニングと血液媒介病原体のトレーニングを完了する必要があります。適切な個人用保護具を着用する必要があります。
