植物カルス培養は、植物における生体異物の代謝分解を正確、効率的、かつ迅速に評価するためのソリューションを提供します。植物のカルス培養は、マイクロバイオームまたは真菌の干渉および光化学的分解を排除し、無傷の植物のマトリックス効果を単純化し、栽培条件を標準化し、処理期間を短縮し、より少ない実験努力を必要とする。本手法は、作物に対する様々な有機汚染物質の取り込み挙動や代謝機構の解明に役立ち、環境リスク評価の取り組みに有用である。
まず、すべての機器をオートクレーブし、UV滅菌された超クリーンな作業台ですべての操作を実行します。春化種子表面を75%エタノールで20分間殺菌します。滅菌脱イオン水で3回すすぎ、20%過酸化水素で20分間滅菌します。
滅菌脱イオン水で種子を6回洗浄した後、1%寒天ゲルを含むpH 5.8のオートクレーブ滅菌したホルモンフリーのムラシゲおよびスクーグ培地に播種して無菌的に発芽させ、摂氏26度で16時間のフォトピリオドで15日間インキュベートします。種子の孵化の15日後、苗の胚軸と子葉を0.5センチメートルの小片に切断して外植片を得る。オキシモンとフィコシアニンを添加した15〜20ミリリットルのオートクレーブ滅菌ムラシゲおよびスクーグ培地を含むシャーレで外植片を形質転換し、摂氏26度の暗所で3〜4週間インキュベートしてカルスを誘導します。
滅菌メスと鉗子を使用して、最初の外植片から形成された直径約1センチメートルのカルスを分離します。処理には、2,4-ジブロモフェノールを10ミリリットルの無菌液ムラシゲおよびスクーグ培地に溶解します。次に、調製した2,4-ジブロモフェノール溶液に3グラムの分離したニンジンカルスを加える。
原稿に記載されているようにブランクコントロールで培地を調製した後、すべてのフラスコを暗所でインキュベートします。サンプルを調製するには、0.45ミクロンのガラス繊維フィルターでろ過することにより、2,3-ジブロモフェノール処理および対照フラスコからカルスを注意深く分離します。カルスを超純水で3回洗浄してから採取してください。
採取したすべてのカルスを凍結乾燥し、0.2グラムの乾燥カルスを70ヘルツのハイスループットティッシュグラインダーで3分間ホモジナイズします。ガラス製マイクロシリンジを使用して、50マイクロリットルのサロゲート重水素化4-n-ナノフェノールをホモジナイズしたカルスとボルテックスに1分間加えます。等比率のメタノールと水を含む5ミリリットルの溶液をスパイクカルスに加え、30分間超音波処理して2,4-ジブロモフェノールおよび代謝産物を抽出する。
抽出後、懸濁液を8, 000 G、摂氏4度で10分間遠心分離し、ピペッティングによって上清を収集します。抽出物を親水性親油性平衡固相抽出またはHLB-SPEカートリッジに毎分1ミリリットルの流速で通します。HLB-SPEカートリッジに6ミリリットルのメタノールを通過させて分析対象物を希釈します。
次に、得られた溶離液を窒素ガスの穏やかな流れの下で1ミリリットルに濃縮し、機器分析を行います。分析のために、カラムヒーターのドアを開きます。次に、カラム入口を注入バルブに接続し、出口を質量分析計の入口に接続して、超高速液体クロマトグラフィーカラムを取り付けます。
溶剤チューブAとBの端を対応する溶剤ボトルに挿入します。シリアル番号別のサンプルバイアルをサンプルトレイの対応する位置に置き、サンプルトレイをサンプルチャンバーに再挿入します。ソフトウェアウィンドウで、[装置]、[インレットメソッド]の順にクリックして、液体クロマトグラムの条件を編集します。
MSメソッドを選択し、マススペクトル分析のパラメータを設定します。[ファイル]、[新規作成] の順にクリックして、データベースを作成し、名前を付けます。上記で作成したサンプルプログラムを、MSファイルを選択し、続いてインレットファイルとボリュームの注入を選択してロードします。
プロジェクトのサンプル フォルダーにデータベースを保存するには、[ファイル] と [保存] をクリックします。次に、メインソフトウェアウィンドウで[実行して開始]を選択し、[サンプルデータの取得]をクリックしてから、[サンプルリストの実行を開始]の[OK]ボタンをクリックしてデータを収集します。データを処理するには、目的のデータ行を選択し、クロマトグラムウィンドウをクリックしてMSスキャンクロマトグラムを表示します。
クロマトグラムウィンドウで、[ディスプレイ]、[TIC]の順にクリックします。スキャンウェーブDSをクリックした後、トレースとOKを追加して、ドーターマススペクトルスキャンを取得します。2,4-ジブロモフェノール処理ニンジンカルス抽出物のクロマトグラムは、対照サンプルと比較して8つの異なる代謝物の存在を示しました。
さらに、クロマトグラムに親2,4-ジブロモフェノールピークがないことは、実験条件下でのニンジンカルス中の2,4-ジブロモフェノールの急速な代謝を示しています。さらに、ニンジンカルス中でインキュベートされた2,4-ジブロモフェノールは、グルコースおよびアミノ酸との直接結合による代謝産物の形成をもたらした。すべての機器、ならびにムラシゲ培地およびスクーグ培地は、植物カルスの分化および維持が無菌条件下で行われるようにオートクレーブ滅菌する必要があります。
この手順に従うオミクスアプローチは、環境汚染物質の明確な植物毒性機構の画像を作成することを可能にします。
