Agradecemos a Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue y Régis Lavigne por sus consejos y trucos con respecto a la preparación de muestras para imágenes MALDI de muestras de plantas.

1. Preparación de la muestra
<ol><li>Obtenga la muestra biológica y manténgala fresca e intacta (por ejemplo, no la fuerce a un tubo) o congele. El protocolo propuesto se aplica a cualquier tipo de muestra biológica sólida (es decir, tejidos vegetales, animales o humanos) para localizar compuestos en tejidos específicos.</li>
	<li>Enfríe un criomicrotoma a -20 °C. Mantenga el porta muestras y la cuchilla a la misma temperatura.</li>
	<li>Si es necesario, incruste el objeto en el medio de incrustación M1 para conservarlo durante el corte.<ol>
<li>Vierta un poco de matriz en un molde de plástico colocado en la cámara del criomicrotome. Agregue rápidamente la muestra y vierta un poco más de medio de incrustación para cubrirla. Mantenga la muestra en el centro del molde a medida que la matriz se solidifica mientras se enfría. NOTA: La incrustación no es necesaria para todos los objetos biológicos. Los objetos homogéneos como los cerebros de ratón no necesitan un medio de incrustación y se pueden cortar congelados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque la muestra incrustada o congelada en el soporte del criomicrotoma y córtela con una cuchilla afilada. Un espesor de 5-30 μm es bueno para muestras de plantas, que son difíciles de cortar debido a su heterogeneidad. Adapta el espesor y la temperatura de corte a la muestra, realizando varios cortes para encontrar las mejores condiciones. En el ejemplo proporcionado, la muestra se cortó a -20 °C. Considere mantener la muestra por debajo de 0 °C para evitar la degradación de la muestra. NOTA: El uso de un microscopio binocular colocado junto al criomicrotoma puede ayudar a determinar la calidad de las rebanadas. Los tejidos deben permanecer intactos.</li>
	<li>Mueva cuidadosamente la rebanada a un portaobjetos recubierto de ITO usando pinzas o un pincel pequeño, luego coloque un dedo debajo del portaobjetos para calentar y secar la muestra. Mantenga el portaobjetos en la cámara del criomicrotoma hasta que todas las muestras estén listas. Saque el portaobjetos de la cámara lentamente para evitar el choque térmico. NOTA: Para verificar qué lado de la diapositiva está recubierto de ITO, coloque una gota de agua en la diapositiva a temperatura ambiente (RT). La gota permanecerá redonda en el lado recubierto de ITO o se aplanará en el lado sin recubrimiento.</li>
	<li>Dibuje marcas en la diapositiva con un rotulador delgado o fluido de corrección y escanee con un escáner de alta resolución antes de la deposición de la matriz. Las marcas se utilizarán para determinar la posición exacta de la muestra en la diapositiva cuando esté en el espectrómetro de masas. La mejor manera de obtener puntos de referencia precisos es dibujar una cruz.</li>
</ol>2. Deposición matricial
<ol><li>Preparar la matriz MALDI: pesar 70 mg de α-ciano-4-hidroxicinámico ácido (HCCA) y diluirlo en 10 mL de una solución de agua y metanol (50:50) con TFA al 0,2%. Sonicar la matriz durante 10 minutos en RT. Puede haber una matriz sólida adicional después de la sonicación. NOTA: Se pueden utilizar diferentes tipos de matrices MALDI dependiendo de los analitos de interés.</li>
	<li>Limpie el robot de deposición de matriz con metanol al 100%.</li>
	<li>Usando metanol y una toallita de precisión, limpie la diapositiva, sosteniendo las muestras sin tocarlas y sin quitar las marcas. Agregue un cubrebocas limpio sobre la diapositiva en un área sin muestra. Esa parte de la diapositiva se coloca sobre el detector óptico para rastrear la deposición de la matriz. NOTA: Para realizar un seguimiento óptico del grosor de la matriz, la diapositiva y el cubrebocas deben estar muy limpios.</li>
	<li>Utilice el robot para la deposición de la matriz: coloque sólo 6 mL de la solución de la matriz en el depósito, y añadir 2 mL de metanol al 100% para un volumen total de 8 mL. NOTA: El registro del espesor de la matriz a lo largo de la deposición es automático y se puede recuperar utilizando una memoria USB. El desarrollo de un método de pulverización no se detalla aquí.</li>
</ol>3. Adquisición de datos
<ol><li>Coloque 1 μL de la matriz en una placa MALDI para calibrar el espectrómetro de masas utilizando los picos de la matriz como referencias. El desarrollo de un método de adquisición en el espectrómetro de masas no se detalla aquí.<ol>
<li>Inserte la placa MALDI en la fuente, haga clic en "Cargar destino" en el software ftmsControl, y espere a que la placa sea cargada.</li>
		<li>Elija la posición del punto de la matriz haciendo clic en el lugar en la imagen que representa la placa MALDI.</li>
		<li>Indique el nombre de la muestra y la carpeta en la pestaña " Información demuestra" del software.</li>
		<li>Comience la adquisición haciendo clic en "Adquisición".</li>
		<li>Mueva la placa ligeramente durante la adquisición usando el puntero del ratón en la pestaña "MALDI video" para que el láser apunte a diferentes puntos.</li>
		<li>Cuando finalice la adquisición, vaya a la pestaña"Calibración",elija la lista de calibración HCCA en Modo cuadrático y haga clic en Automático. El resultado de la calibración global se indica en la ventana " Diagrama decalibración" y debe ser inferior a 0,2 ppm para un SolariX XR 7T.</li>
		<li>Si la calibración es buena, haga clic en "Aceptar" y guarde el método.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez finalizada la deposición de la matriz en las muestras, coloque la diapositiva en un adaptador de diapositivas y recupere la posición de las marcas utilizando una cubierta de plástico.</li>
	<li>En el software flexImaging, configure una nueva ejecución de imágenes utilizando la primera ventana que se abre con el software.<ol>
<li>Asigne un nombre a la ejecución de imágenes, seleccione el Directorio de resultadosy haga clic en Siguiente.</li>
		<li>Indique el tamaño del ráster (es decir, la región de medición definida por el usuario), elija el método que se utilizará (calibrado en la sección 3.1) y haga clic en Siguiente.</li>
		<li>Cargue la imagen óptica de la diapositiva obtenida en el paso 1.6 después de escanear la diapositiva y haga clic en Siguiente.</li>
		<li>La imagen se abre en una ventana más ancha. Utilice las marcas en la diapositiva para enseñar la posición de las diapositivas: en ftmsControl, coloque el objetivo de la ventana de vídeo MALDI en la posición exacta de una marca, a continuación, vuelva a felxImaging y haga clic en el mismo punto exacto en la imagen óptica. Repita esto para tres puntos independientes. La cubierta de plástico que lleva las marcas se coloca en una placa MALDI para recuperar su posición y facilitar la enseñanza. NOTA: Si las marcas se hicieron con un marcador, agregar líquido de corrección blanco en la parte posterior de la diapositiva puede hacer que se destaquen durante la enseñanza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dibuje las regiones de interés en las muestras en el software flexImaging utilizando las herramientas "Agregar regiones de medición".</li>
	<li>Guarde la ejecución de imágenes y una "Secuencia autoexecuta" si se van a analizar varias muestras.</li>
	<li>Inicie una secuencia usando "AutoXecute Batch Runner" si se analizan varias muestras. Nota : sincronizar los datos regularmente a una ubicación segura.</li>
</ol>4. Tratamiento de datos
<ol><li>Importe los datos sin procesar al software de visualización (SCiLS Lab) y cree un conjunto de datos. Esto se hace en dos pasos separados en este software.<ol>
<li>Utilice la herramienta "Importador por lotes" y seleccione los datos sin procesar, indique el directorio de destino y haga clic en "Importar".</li>
		<li>Después de la importación, se pueden combinar varios conjuntos de datos para su posterior análisis. Para combinar conjuntos de datos, utilice el"Archivo| Nuevo| Conjunto de datos" herramienta.</li>
		<li>Seleccione el tipo de instrumento utilizado para la adquisición, agregue los conjuntos de datos importados haciendo clic en "+", y organice las imágenes haciendo clic y arrastrando los objetos.</li>
		<li>Compruebe la configuración del rango de masa o modifíquelo si es necesario indicando el rango de interés. Haga clic en Siguiente para ver el resumen de importación e iniciar la importación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizar el m/z de interés en los diferentes tejidos de una muestra y/o en diferentes muestras. Simplemente haga clic en los espectros para seleccionar el m/z de interés o escriba el valor en el cuadro m/z. <ol>
<li>Realice las pruebas estadísticas si es necesario buscar para los valores colocalized o discriminativos entre diversos tejidos y/o diversas muestras para determinar el m/z del interés. Las herramientas están disponibles en el menú "Herramienta" y no serán descritas en este protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exporte el m/z de interés (por ejemplo, compuestos colocalizados y discriminativos) como un archivo .csv desde la pestaña Objeto. El conjunto de datos completo también se puede exportar si no es demasiado grande (es decir, un máximo de 60.000 líneas). Haga clic en el icono "Exportar" en el lado derecho de la región de interés indicada por una flecha roja.</li>
	<li>Importe el archivo .csv para crear un nuevo conjunto de datos en el software de anotación (Metaboscape). Haga clic en "Proyectos | Importar proyecto CSV". Tenga en cuenta que solo se considerará la m/z exacta y se perderá el perfil isotópico. NOTA: La versión de software 5.0 permite la importación directa de datos desde el software de visualización, lo que permite una anotación más precisa, ya que se puede considerar el perfil isotópico.</li>
	<li>Anote con listas de analitos personalizadas, que se pueden derivar de bases de datos disponibles públicamente. Una plantilla es dada por el software para crear listas de analitos.</li>
	<li>Utilice el software de predicción (Metabolite Predict) para realizar una predicción in silico de los metabolitos de los compuestos anotados. Se necesita la fórmula desarrollada del compuesto de interés, ya sea dibujado por el usuario en el software o importado como un archivo .mol. A continuación, el método es un simple protocolo paso a paso.</li>
	<li>Recupere la lista de metabolitos, cree una lista de analitos y utilícese en el software de anotación para anotar los datos sin procesar con metabolitos predichos. Alternativamente, si la lista de metabolitos es corta, búscala manualmente en el paso 4.8.</li>
	<li>Visualice la distribución tisular de los metabolitos en los datos sin procesar en el software de visualización.</li>
	<li>Recupere los nombres de las enzimas implicadas en los procesos metabólicos en el software de predicción haciendo clic derecho en el metabolito predicho de interés.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+aquatic+plant-based+systems:+A+review.">Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review.</a> Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).</li><li>Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+of+estrogens+on+human,+animal+and+plant+life:+A+critical+review.">Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review.</a> Environment International. 99, 107-119 (2017).</li><li>Prosser, R. S., Sibley, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+health+risk+assessment+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+plant+tissue+due+to+biosolids+and+manure+amendments,+and+wastewater+irrigation.">Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation.</a> Environment International. 75, 223-233 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+biochar+to+soils+may+result+in+plant+contamination+and+human+cancer+risk+due+to+exposure+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons.">Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons.</a> Environment International. 121, 169-177 (2018).</li><li>Marsik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+in+higher+plants:+A+model+Arabidopsis+thaliana+cell+suspension+culture+system.">Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system.</a> Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+by+Phragmites+australis:+uptake+and+phytodegradation.">Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation.</a> Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).</li><li>Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schr&#246;der, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+acetaminophen+(paracetamol)+in+plants-two+independent+pathways+result+in+the+formation+of+a+glutathione+and+a+glucose+conjugate.">Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate.</a> Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).</li><li>Thomas, F., C&#233;bron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+rhizosphere+effect+on+available+carbon+sources,+phenanthrene+degradation,+and+active+microbiome+in+an+aged-contaminated+industrial+soil.">Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).</li><li>Villette, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+micropollutants+and+associated+stress+response+in+Populus+nigra+leaves.">In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves.</a> Environment International. 126, 523-532 (2019).</li><li>Sandermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolism+of+organic+xenobiotics.+Status+and+prospects+of+the+'Green+Liver'+concept.">Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept.</a> Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).</li><li>Sula, B., Deveci, E., &#214;zevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+histopathological+changes+in+the+skin+of+rats+after+administration+of+lead+acetate.">Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate.</a> International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).</li><li>Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics+metabolization+in+Salix+alba+leaves+uncovered+by+mass+spectrometry+imaging.">Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging.</a> Metabolomics. 15, 122 (2019).</li><li>Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Molecular+Analysis+of+Whole-Body+Animal+Tissue+Sections+by+Imaging+MALDI+Mass+Spectrometry.">Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La parte crítica de este protocolo es la preparación de la muestra: la muestra debe ser suave e intacta. El corte es la parte más difícil, ya que la temperatura y el espesor de la muestra pueden variar dependiendo del tipo de muestra estudiada. Los tejidos animales suelen ser homogéneos y más fáciles de cortar. Las muestras de plantas a menudo incorporan diferentes estructuras y, por lo tanto, son más difíciles de mantener intactas, ya que la hoja encuentra tejidos vasculares blandos, duros o vacíos. Es muy rec...

Los xenobióticos están ampliamente distribuidos en todo el mundo debido a las actividades humanas. Algunos de estos compuestos son solubles en agua y absorbidos por el suelo1,y entran en la cadena alimentaria cuando se acumulan en los tejidos vegetales2,3,4. Las plantas son devoradas por insectos y herbívoros, que son presa de otros organismos. La ingesta de algunos xenobióticos y su impacto en la salud de una planta se han descrito5,6,7,8,pero sólo recientemente a nivel tisular9. Por lo tanto, todavía no está claro dónde o cómo se produce el metabolismo de los xenobióticos, o si los metabolitos específicos de las plantas están correlacionados con la acumulación xenobiótica en tejidos específicos10. Por otra parte, la mayoría de la investigación ha pasado por alto el metabolismo de los xenobióticos y sus metabolitos en las plantas, por lo que poco se sabe acerca de estas reacciones en los tejidos de las plantas.
Aquí se propone un método para investigar reacciones enzimáticas en muestras biológicas que pueden estar asociadas a la localización tisular de sustratos y productos de las reacciones. El método puede dibujar el perfil metabólico completo de una muestra biológica en un experimento, ya que el análisis no está dirigido y se puede investigar utilizando listas personalizadas de analitos de interés. Se proporciona una lista de candidatos con seguimiento en el conjunto de datos original. Si uno o varios analitos de interés se observan en la muestra, la localización específica del tejido puede proporcionar información importante sobre los procesos biológicos relacionados. Los analitos de interés pueden ser modificados in silico utilizando las leyes biológicas pertinentes para buscar posibles productos/metabolitos. La lista de metabolitos obtenidos se utiliza para analizar los datos originales mediante la identificación de las enzimas implicadas y la localización de las reacciones en los tejidos, ayudando así a comprender los procesos metabólicos que ocurren. Ningún otro método proporciona información sobre los tipos de reacciones que ocurren en las muestras biológicas, la localización de los compuestos de interés y sus metabolitos relacionados. Este método se puede utilizar en cualquier tipo de material biológico una vez que los tejidos frescos e intactos están disponibles y los compuestos de interés pueden ser ionizados. El protocolo propuesto fue publicado en Villette et al.12 y se detalla aquí para su uso por la comunidad científica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slips</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">267942</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Excel</td>
			<td style="width:163px;">Microsoft corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">flexImaging</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ftmsControl</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">GTX primescan</td>
			<td style="width:163px;">GX Microscopes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HCCA MALDI matrix</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8201344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ImagePrep</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ITO-coated slides</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">237001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">M1-embedding matrix</td>
			<td style="width:163px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Metabolite Predict</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Metaboscape</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MX 35 Ultra blades</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15835682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">SCiLS Lab</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">SolariX XR 7Tesla</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The method proposed is not limited to this instrument</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Spray sheets for ImagePrep</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8261614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TFA</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of xenobiotics metabolism in salix alba leaves via mass spectrometry imaging

El método presentado utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para establecer el perfil metabólico de las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. Utilizando un enfoque no dirigido, los metabolitos de las plantas y los xenobióticos de interés se identifican y localizan en los tejidos de las plantas para descubrir patrones de distribución específicos. A continuación, se realiza una predicción in silico de metabolitos potenciales (es decir, catabolitos y conjugados) a partir de los xenobióticos identificados. Cuando se localiza un metabolito xenobiótico en el tejido, se registra el tipo de enzima implicada en su alteración por la planta. Estos resultados se utilizaron para describir diferentes tipos de reacciones biológicas que ocurren en las hojas de S. alba en respuesta a la acumulación xenobiótica en las hojas. Los metabolitos se predijeron en dos generaciones, permitiendo la documentación de reacciones biológicas sucesivas para transformar xenobióticos en los tejidos foliares.

Este protocolo se aplicó a hojas frescas muestreadas de un árbol de S. alba expuesto a xenobióticos en el medio ambiente. El proceso se representa en la Figura 1. El primer paso es preparar rodajas delgadas de la muestra de interés. Las muestras de plantas son a menudo más difíciles de cortar que las muestras de animales, ya que los tejidos son heterogéneos y pueden contener agua y / o aire. Esta dificultad se maneja utilizando el medio de incrustación, que forma un bloque h...

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Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

Este método utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para comprender los procesos metabólicos en las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. El método permite la localización espacial de compuestos de interés y sus metabolitos predichos dentro de tejidos específicos e intactos.

Investigación Del Metabolismo De Xenobióticos En Hojas De Salix alba A Través De Imágenes Espectrometría De Masas

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...

investigation-xenobiotics-metabolism-salix-alba-leaves-via-mass

Research

JoVE Journal

Environment

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

3.0K vistas.  Université de Strasbourg. Este método utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para comprender los procesos metabólicos en las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. El método permite la localización espacial de compuestos de interés y sus metabolitos predichos dentro de tejidos específicos e intactos.

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Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

Producción masiva de Aedes aegypti genéticamente modificados para liberaciones de campo en Brasil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Investigación

Medio ambiente

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimizar la combustión Gas Ciudad para promover el crecimiento de microalgas en fotobiorreactores a través de Simulaciones computacionales

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to inorganic arsenic through diet, information about distribution of arsenic species in various food types must be generated. A method, previously validated in a collaborative trial, has been applied to determine inorganic arsenic in a wide variety of food matrices, covering grains, mushrooms and food of marine origin (31 samples in total). The method is based on detection by flow injection-hydride generation-atomic absorption spectrometry of the iAs selectively extracted into chloroform after digestion of the proteins with concentrated HCl. The method is characterized by a limit of quantification of 10 &#181;g/kg dry weight, which allowed quantification of inorganic arsenic in a large amount of food matrices. Information is provided about performance scores given to results obtained with this method and which were reported by different laboratories in several proficiency tests. The percentage of satisfactory results obtained with the discussed method is higher than that of the results obtained with other analytical approaches.

The usefulness of an analytical method to determine inorganic arsenic in a wide range of food matrices is demonstrated. The method consists of selective extraction of inorganic arsenic into chloroform with a final determination by hydride generation-atomic absorption spectrometry.

Determinación de arsénico inorgánico en una amplia gama de alimentos Matrices mediante generación de hidruros - espectrometría de absorción atómica.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Evaluación de las capacidades de eliminación de materia particulada de árbol hojas

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identificar por-polifluorado química especies y con un flujo de trabajo combinado dirigida y no dirigida-detección de alta resolución espectrometría de masas

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The power of their influence is in extraradical mycelia that spread beyond nutrient depletion zones found near roots to ultimately interconnect individuals within a common mycorrhizal network (CMN). Most experiments, however, have investigated the role of AM fungi in plant interactions by growing plants with versus without mycorrhizal fungi, a method that fails to explicitly address the role of CMNs. Here, we propose a method that manipulates CMNs to investigate their role in plant interactions. Our method uses modified containers with conical bottoms with a nylon mesh and/or hydrophobic material covering slotted openings, 15N fertilizer, and a nutrient-poor interstitial sand. CMNs are left either intact between interacting individuals, severed by rotation of containers, or prevented from forming by a solid barrier. Our findings suggest that rotating containers is sufficient to disrupt CMNs and prevent their effects on plant interactions across CMNs. Our approach is advantageous because it mimics aspects of nature, such as seedlings tapping into already established CMNs and the use of a suite of AM fungi that may provide diverse benefits. Although our experiment is limited to investigating plants at the seedling stage, plant interactions across CMNs can be detected using our approach which therefore can be applied to investigate biological questions about the functioning of CMNs in ecosystems.

Most plants within communities likely are interconnected by arbuscular mycorrhizal (AM) fungi, but mediation of plant interactions by them has been investigated primarily by growing plants with versus without mycorrhizas. We present a method to manipulate common mycorrhizal networks among mycorrhizal plants to investigate their consequences for plant interactions.

Investigación de las interacciones de la planta a través de redes de micorrizas comunes utilizando núcleos girados

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The ...

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural losses. To understand the biology of such pest moths, fundamental techniques have been in high demand. Here, methods for mass-rearing, observations, and molecular studies are developed using two tea tortrix, Homona magnanima and Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insects were mass-reared with sliced artificial diet and maintained by inbreeding for over 100 generations by considering their biological characteristics. Insects have various sex dimorphisms; hence it is difficult to distinguish the sex during the developing stages, which have prevented subsequent assays. The present work highlighted that the sex of tortricids larvae could be determined by observing testes or lactic-acetic orcein staining to visualize the female-specific W chromosome. Moreover, using the sex determination methods, the present study enabled nucleic acid extractions from sex determined embryos and application toward high throughput sequencing. These tips are applicable for other pest insects and will facilitate further morphological and genetic studies.

The present protocol describes the rearing method of tortricid pest insects in the laboratories. The procedures to distinguish insects' sex and extract nucleic acids for high throughput sequencing are established using two tortricid pests.

Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...