Wir danken Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue und Régis Lavigne für ihre Tipps und Tricks zur Probenvorbereitung für die MALDI-Bildgebung von Pflanzenproben.

1. Probenvorbereitung
<ol><li>Erhalten Sie die biologische Probe und halten Sie sie entweder frisch und intakt (z. B. nicht in ein Röhrchen zwingen) oder frieren Sie sie ein. Das vorgeschlagene Protokoll gilt für jede Art von fester biologischer Probe (d. H. Pflanzliches, tierisches oder menschliches Gewebe), um Verbindungen in bestimmten Geweben zu lokalisieren.</li>
	<li>Kühlen Sie ein Kryomikrotom auf -20 °C ab. Halten Sie den Probenhalter und die Klinge auf der gleichen Temperatur.</li>
	<li>Betten Sie das Objekt bei Bedarf in das M1-Einbettungsmedium ein, um es während des Schneidens zu erhalten.<ol>
<li>Gießen Sie etwas Matrix in eine Kunststoffform, die in der Kryomikrotomkammer platziert ist. Fügen Sie die Probe schnell hinzu und gießen Sie etwas mehr Einbettungsmedium, um sie abzudecken. Halten Sie die Probe in der Mitte der Form, während die Matrix beim Abkühlen erstarrt. HINWEIS: Die Einbettung ist nicht für alle biologischen Objekte erforderlich. Homogene Objekte wie Mausgehirne benötigen kein Einbettmedium und können eingefroren geschnitten werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die eingebettete oder gefrorene Probe auf den Kryomicrotomhalter und schneiden Sie sie mit einer scharfen Klinge. Eine Dicke von 5–30 μm eignet sich gut für Pflanzenproben, die aufgrund ihrer Heterogenität schwer zu schneiden sind. Passen Sie die Schnittdicke und -temperatur an die Probe an und machen Sie mehrere Schnitte, um die besten Bedingungen zu finden. Im angegebenen Beispiel wurde die Probe bei -20 °C geschnitten. Erwägen Sie, die Probe unter 0 °C zu halten, um einen Probenabbau zu vermeiden. HINWEIS: Die Verwendung eines binokularen Mikroskops, das neben dem Kryomikrotom platziert wird, kann helfen, die Qualität der Scheiben zu bestimmen. Das Gewebe muss intakt bleiben.</li>
	<li>Bewegen Sie die Scheibe vorsichtig mit einer Zette oder einem kleinen Pinsel zu einem ITO-beschichteten Objektträger und legen Sie dann einen Finger unter den Dia, um die Probe aufzuwärmen und zu trocknen. Halten Sie den Objektträger in der Kryomikrotomkammer, bis alle Proben fertig sind. Nehmen Sie den Schieber langsam aus der Kammer, um einen Hitzeschock zu vermeiden. HINWEIS: Um zu überprüfen, welche Seite der Rutsche ITO-beschichtet ist, legen Sie einen Wassertropfen bei Raumtemperatur (RT) auf die Rutsche. Der Tropfen bleibt auf der ITO-beschichteten Seite rund oder flacht auf der unbeschichteten Seite ab.</li>
	<li>Zeichnen Sie Markierungen auf dem Dia mit einem dünnen Markerstift oder einer Korrekturflüssigkeit und scannen Sie es vor der Matrixabscheidung mit einem hochauflösenden Scanner. Die Markierungen werden verwendet, um die genaue Position der Probe auf dem Objektträger zu bestimmen, wenn sie sich im Massenspektrometer befindet. Der beste Weg, um genaue Bezugspunkte zu erhalten, ist das Zeichnen eines Kreuzes.</li>
</ol>2. Matrixabscheidung
<ol><li>Bereiten Sie die MALDI-Matrix vor: Wiegen Sie 70 mg α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA) -Matrix und verdünnen Sie sie in 10 ml einer Wasser- und Methanollösung (50:50) mit 0,2% TFA. Beschallen Sie die Matrix für 10 Minuten bei RT. Nach der Beschallung kann zusätzliche feste Matrix vorhanden sein. HINWEIS: Je nach den interessierenden Analyten können verschiedene Arten von MALDI-Matrizen verwendet werden.</li>
	<li>Reinigen Sie den Matrixabscheideroboter mit 100% Methanol.</li>
	<li>Reinigen Sie den Schlitten mit Methanol und einem Präzisionstuch, halten Sie die Proben fest, ohne sie zu berühren und ohne die Markierungen zu entfernen. Fügen Sie einen sauberen Abdeckr über den Dia in einem Bereich ohne Probe hinzu. Dieser Teil des Objektträgers wird dann über den optischen Detektor gelegt, um die Matrixablagerung zu verfolgen. HINWEIS: Um die Matrixdicke optisch zu verfolgen, müssen der Schlitten und der Abdeckr sehr sauber sein.</li>
	<li>Verwenden Sie den Roboter für die Matrixabscheidung: Legen Sie nur 6 ml der Matrixlösung in das Reservoir und fügen Sie 2 ml 100% Methanol für ein Gesamtvolumen von 8 ml hinzu. HINWEIS: Die Aufzeichnung der Matrixdicke entlang der Abscheidung erfolgt automatisch und kann mit einem USB-Stick wiederhergestellt werden. Die Entwicklung einer Sprühmethode wird hier nicht näher erläutert.</li>
</ol>3. Datenerfassung
<ol><li>Legen Sie 1 μL der Matrix auf eine MALDI-Platte, um das Massenspektrometer mit den Matrixpeaks als Referenzen zu kalibrieren. Die Entwicklung einer Erfassungsmethode am Massenspektrometer wird hier nicht näher erläutert.<ol>
<li>Setzen Sie die MALDI-Platte in die Quelle ein, klicken Sie in der ftmsControl-Software auf "Load Target" und warten Sie, bis die Platte geladen ist.</li>
		<li>Wählen Sie die Position des Matrixspots aus, indem Sie auf den Spot im Bild klicken, der die MALDI-Platte darstellt.</li>
		<li>Geben Sie den Beispielnamen und den Ordner auf der Registerkarte "Beispielinformationen" der Software an.</li>
		<li>Starten Sie die Erfassung, indem Sie auf "Akquisition" klicken.</li>
		<li>Bewegen Sie die Platte während der Aufnahme mit dem Mauszeiger auf der Registerkarte "MALDI-Video" leicht, so dass der Laser auf verschiedene Stellen zeigt.</li>
		<li>Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, gehen Sie zur Registerkarte "Kalibrierung", wählen Sie die HCCA-Kalibrierungsliste im quadratischen Modus und klicken Sie auf Automatisch. Das globale Kalibrierungsergebnis wird im Fenster "Calibration Plot" angezeigt und sollte für eine SolariX XR 7T weniger als 0,2 ppm betragen.</li>
		<li>Wenn die Kalibrierung gut ist, klicken Sie auf "Akzeptieren" und speichern Sie die Methode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die Matrixabscheidung auf den Proben abgeschlossen ist, legen Sie den Dia in einen Diaadapter und rufen Sie die Position der Markierungen mit einer Kunststoffabdeckung ab.</li>
	<li>Richten Sie in der flexImaging-Software einen neuen Imaging-Lauf mit dem ersten Fenster ein, das sich mit der Software öffnet.<ol>
<li>Benennen Sie den Imaging-Lauf, wählen Sie das Ergebnisverzeichnis aus,und klicken Sie auf Weiter.</li>
		<li>Geben Sie die Rastergröße an (d. h. den benutzerdefinierten Messbereich), wählen Sie die zu verwendende Methode aus (kalibriert in Abschnitt 3.1), und klicken Sie auf Weiter.</li>
		<li>Laden Sie das optische Bild des Dias, das Sie in Schritt 1.6 erhalten haben, nach dem Scannen des Dias und klicken Sie auf Weiter.</li>
		<li>Das Bild wird in einem breiteren Fenster geöffnet. Verwenden Sie die Markierungen auf der Folie, um die Position der Folien zu lehren: Platzieren Sie in ftmsControldas Ziel des MALDI-Videofensters auf der genauen Position einer Markierung, kehren Sie dann zu felxImaging zurück und klicken Sie auf genau den gleichen Punkt auf dem optischen Bild. Wiederholen Sie dies für drei unabhängige Punkte. Die Kunststoffabdeckung mit den Markierungen wird auf eine MALDI-Platte gelegt, um ihre Position wiederherzustellen und den Unterricht zu erleichtern. HINWEIS: Wenn die Markierungen mit einem Marker gemacht wurden, kann das Hinzufügen von weißer Korrekturflüssigkeit auf der Rückseite der Folie dazu führen, dass sie während des Unterrichts hervorstechen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeichnen Sie die interessierenden Bereiche in den Proben in der flexImaging-Software mit den Werkzeugen "Messbereiche hinzufügen".</li>
	<li>Speichern Sie den Imaging-Lauf und eine "AutoXecute-Sequenz", wenn mehrere Proben analysiert werden sollen.</li>
	<li>Starten Sie eine Sequenz mit" AutoXecute Batch Runner", wenn mehrere Proben analysiert werden. HINWEIS: Synchronisieren Sie die Daten regelmäßig an einen sicheren Ort.</li>
</ol>4. Datenverarbeitung
<ol><li>Importieren Sie die Rohdaten in die Visualisierungssoftware (SCiLS Lab) und erstellen Sie einen Datensatz. Dies geschieht in dieser Software in zwei separaten Schritten.<ol>
<li>Verwenden Sie das Werkzeug "Batch Importer" und wählen Sie die Rohdaten aus, geben Sie das Zielverzeichnis an und klicken Sie auf "Importieren".</li>
		<li>Nach dem Import können mehrere Datensätze zur weiteren Analyse kombiniert werden. Um Datensätze zu kombinieren, verwenden Sie die "Datei| Neu| Datensatz" Werkzeug.</li>
		<li>Wählen Sie den für die Erfassung verwendeten Instrumententyp aus, fügen Sie die importierten Datensätze hinzu, indem Sie auf "+" klicken, und ordnen Sie die Bilder an, indem Sie auf die Objekte klicken und sie ziehen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Massenbereichseinstellungen oder ändern Sie sie bei Bedarf, indem Sie den interessierende Bereich angeben. Klicken Sie auf Weiter, um die Importzusammenfassung anzuzeigen und den Import zu starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualisieren Sie das m/z von Interesse in den verschiedenen Geweben einer Probe und/oder in verschiedenen Proben. Klicken Sie einfach auf die Spektren, um das gewünschte m/z auszuwählen, oder geben Sie den Wert in das Feld m/z ein.<ol>
<li>Führen Sie bei Bedarf statistische Tests durch, um nach kolokalisierten oder unterscheidenden Werten zwischen verschiedenen Geweben und / oder verschiedenen Proben zu suchen, um die interessierenden m / z zu bestimmen. Die Werkzeuge sind im Menü "Tool" verfügbar und werden in diesem Protokoll nicht beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exportieren Sie die interessierenden m/z.B. kolokalisierten, diskriminativen Verbindungen) als .csv Datei aus der Registerkarte Objekt. Der gesamte Datensatz kann auch exportiert werden, wenn er nicht zu groß ist (d.h. maximal 60.000 Zeilen). Klicken Sie auf das Symbol "Exportieren" auf der rechten Seite der Region, die durch einen roten Pfeil gekennzeichnet ist.</li>
	<li>Importieren Sie die .csv Datei, um einen neuen Datensatz in der Anmerkungssoftware (Metaboscape) zu erstellen. Klicken Sie auf "Projekte | CSV-Projekt importieren". Beachten Sie, dass nur das genaue m/z berücksichtigt wird und das Isotopenprofil verloren geht. HINWEIS: Die Softwareversion 5.0 ermöglicht den direkten Import von Daten aus der Visualisierungssoftware, was eine genauere Annotation ermöglicht, da das Isotopenprofil berücksichtigt werden kann.</li>
	<li>Kommentieren Sie mit maßgeschneiderten Analytenlisten, die aus öffentlich zugänglichen Datenbanken abgeleitet werden können. Eine Vorlage wird von der Software zur Erstellung von Analytenlisten gegeben.</li>
	<li>Verwenden Sie die Vorhersagesoftware (Metabolite Predict), um eine In-silico-Vorhersage der Metaboliten der annotierten Verbindungen durchzuführen. Die entwickelte Formel des Zinseszinses wird benötigt, entweder vom Benutzer in der Software gezeichnet oder als .mol-Datei importiert. Dann ist die Methode ein einfaches Schritt-für-Schritt-Protokoll.</li>
	<li>Stellen Sie die Liste der Metaboliten wieder her, erstellen Sie eine Analytenliste und verwenden Sie sie in der Annotationssoftware, um die Rohdaten mit vorhergesagten Metaboliten zu kommentieren. Alternativ, wenn die Liste der Metaboliten kurz ist, suchen Sie manuell in Schritt 4.8 danach.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Gewebeverteilung der Metaboliten in den Rohdaten in der Visualisierungssoftware.</li>
	<li>Stellen Sie die Namen der Enzyme wieder her, die an den Stoffwechselprozessen beteiligt sind, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den vorhergesagten Metaboliten von Interesse klicken.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+aquatic+plant-based+systems:+A+review.">Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review.</a> Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).</li><li>Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+of+estrogens+on+human,+animal+and+plant+life:+A+critical+review.">Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review.</a> Environment International. 99, 107-119 (2017).</li><li>Prosser, R. S., Sibley, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+health+risk+assessment+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+plant+tissue+due+to+biosolids+and+manure+amendments,+and+wastewater+irrigation.">Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation.</a> Environment International. 75, 223-233 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+biochar+to+soils+may+result+in+plant+contamination+and+human+cancer+risk+due+to+exposure+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons.">Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons.</a> Environment International. 121, 169-177 (2018).</li><li>Marsik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+in+higher+plants:+A+model+Arabidopsis+thaliana+cell+suspension+culture+system.">Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system.</a> Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+by+Phragmites+australis:+uptake+and+phytodegradation.">Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation.</a> Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).</li><li>Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schr&#246;der, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+acetaminophen+(paracetamol)+in+plants-two+independent+pathways+result+in+the+formation+of+a+glutathione+and+a+glucose+conjugate.">Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate.</a> Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).</li><li>Thomas, F., C&#233;bron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+rhizosphere+effect+on+available+carbon+sources,+phenanthrene+degradation,+and+active+microbiome+in+an+aged-contaminated+industrial+soil.">Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).</li><li>Villette, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+micropollutants+and+associated+stress+response+in+Populus+nigra+leaves.">In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves.</a> Environment International. 126, 523-532 (2019).</li><li>Sandermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolism+of+organic+xenobiotics.+Status+and+prospects+of+the+'Green+Liver'+concept.">Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept.</a> Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).</li><li>Sula, B., Deveci, E., &#214;zevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+histopathological+changes+in+the+skin+of+rats+after+administration+of+lead+acetate.">Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate.</a> International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).</li><li>Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics+metabolization+in+Salix+alba+leaves+uncovered+by+mass+spectrometry+imaging.">Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging.</a> Metabolomics. 15, 122 (2019).</li><li>Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Molecular+Analysis+of+Whole-Body+Animal+Tissue+Sections+by+Imaging+MALDI+Mass+Spectrometry.">Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Der kritische Teil dieses Protokolls ist die Probenvorbereitung: Die Probe muss weich und intakt sein. Das Schneiden ist der schwierigste Teil, da die Temperatur und Dicke der Probe je nach Art der untersuchten Probe variieren kann. Tierische Gewebe sind in der Regel homogen und leichter zu schneiden. Pflanzenproben enthalten oft unterschiedliche Strukturen und sind daher schwieriger intakt zu halten, da die Klinge auf weiches, hartes oder leeres Gefäßgewebe trifft. Es wird dringend empfohlen, bei der Arbeit mit Pflanz...

Xenobiotika sind aufgrund menschlicher Aktivitäten auf der ganzen Welt weit verbreitet. Einige dieser Verbindungen sind wasserlöslich und werden vom Boden1absorbiert und gelangen in die Nahrungskette, wenn sie sich in Pflanzengewebenanreichern 2,3,4. Die Pflanzen werden von Insekten und Pflanzenfressern gefressen, die anderen Organismen zum Opfer stehen. Die Einnahme einiger Xenobiotika und ihre Auswirkungen auf die Gesundheit einer Pflanze wurdenbeschrieben 5,6,7,8, aber erst kürzlich auf Gewebeebene9. Daher ist noch unklar, wo oder wie der Stoffwechsel von Xenobiotika auftritt oder ob bestimmte Pflanzenmetaboliten mit der xenobiotischen Akkumulation in bestimmten Geweben korrelieren10. Darüber hinaus haben die meisten Forschungen den Stoffwechsel von Xenobiotika und ihren Metaboliten in Pflanzen übersehen, so dass wenig über diese Reaktionen in Pflanzengewebe bekannt ist.
Hier wird eine Methode zur Untersuchung enzymatischer Reaktionen in biologischen Proben vorgeschlagen, die mit der Gewebelokalisation von Substraten und Produkten der Reaktionen in Verbindung gebracht werden können. Die Methode kann das vollständige Stoffwechselprofil einer biologischen Probe in einem Experiment zeichnen, da die Analyse nicht zielgerichtet ist und mit benutzerdefinierten Listen von Analyten von Interesse untersucht werden kann. Bereitgestellt wird eine Liste der Kandidaten, die im ursprünglichen Datensatz verfolgt wurden. Werden in der Probe ein oder mehrere interessierende Analyten notiert, kann die spezifische Gewebelokalisation wichtige Informationen über die damit verbundenen biologischen Prozesse liefern. Die interessierenden Analyten können dann in silico unter Verwendung relevanter biologischer Gesetze modifiziert werden, um nach möglichen Produkten/Metaboliten zu suchen. Die Liste der erhaltenen Metaboliten wird dann verwendet, um die ursprünglichen Daten zu analysieren, indem die beteiligten Enzyme identifiziert und die Reaktionen in den Geweben lokalisiert werden, um so die auftretenden Stoffwechselprozesse zu verstehen. Keine andere Methode liefert Informationen über die Arten von Reaktionen, die in den biologischen Proben auftreten, die Lokalisation der interessierenden Verbindungen und ihre verwandten Metaboliten. Diese Methode kann auf jeder Art von biologischem Material angewendet werden, sobald frisches und intaktes Gewebe verfügbar ist und die interessierenden Verbindungen ionisiert werden können. Das vorgeschlagene Protokoll wurde in Villette et al.12 veröffentlicht und ist hier für die Verwendung durch die wissenschaftliche Gemeinschaft detailliert beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slips</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">267942</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Excel</td>
			<td style="width:163px;">Microsoft corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">flexImaging</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ftmsControl</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">GTX primescan</td>
			<td style="width:163px;">GX Microscopes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HCCA MALDI matrix</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8201344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ImagePrep</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ITO-coated slides</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">237001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">M1-embedding matrix</td>
			<td style="width:163px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Metabolite Predict</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Metaboscape</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MX 35 Ultra blades</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15835682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">SCiLS Lab</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">SolariX XR 7Tesla</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The method proposed is not limited to this instrument</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Spray sheets for ImagePrep</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8261614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TFA</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of xenobiotics metabolism in salix alba leaves via mass spectrometry imaging

Die vorgestellte Methode verwendet massenspektrometrische Bildgebung (MSI), um das metabolische Profil von S. alba-Blättern zu bestimmen, wenn sie Xenobiotika ausgesetzt sind. Mit einem nicht zielgerichteten Ansatz werden Pflanzenmetaboliten und Xenobiotika von Interesse identifiziert und in Pflanzengeweben lokalisiert, um spezifische Verteilungsmuster aufzudecken. Anschließend wird eine in silico Vorhersage potenzieller Metaboliten (d.h. Katabolite und Konjugate) aus den identifizierten Xenobiotika durchgeführt. Wenn sich ein xenobiotischer Metabolit im Gewebe befindet, wird die Art des Enzyms aufgezeichnet, das an seiner Veränderung durch die Pflanze beteiligt ist. Diese Ergebnisse wurden verwendet, um verschiedene Arten von biologischen Reaktionen zu beschreiben, die in S. alba-Blättern als Reaktion auf xenobiotische Ansammlung in den Blättern auftreten. Die Metaboliten wurden in zwei Generationen vorhergesagt, was die Dokumentation aufeinanderfolgender biologischer Reaktionen zur Umwandlung von Xenobiotika im Blattgewebe ermöglichte.

Dieses Protokoll wurde auf frische Blätter angewendet, die von einem S. alba-Baum entnommen wurden, der Xenobiotika in der Umwelt ausgesetzt war. Der Prozess ist in Abbildung 1dargestellt. Der erste Schritt besteht darin, dünne Scheiben der interessierenden Probe vorzubereiten. Pflanzenproben sind oft schwieriger zu schneiden als Tierproben, da die Gewebe heterogen sind und Wasser und/oder Luft enthalten können. Diese Schwierigkeit wird mit dem Einbettungsmedium bewältigt, das e...

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Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

Diese Methode verwendet massenspektrometrische Bildgebung (MSI), um Stoffwechselprozesse in S. alba-Blättern zu verstehen, wenn sie Xenobiotika ausgesetzt sind. Die Methode ermöglicht die räumliche Lokalisierung von interessierenden Verbindungen und ihren vorhergesagten Metaboliten in spezifischen, intakten Geweben.

Untersuchung des Xenobiotika-Stoffwechsels in Salix alba-Blättern mittels Massenspektrometrie-Bildgebung

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...

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Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

3.0K Aufrufe.  Université de Strasbourg. Diese Methode verwendet massenspektrometrische Bildgebung (MSI), um Stoffwechselprozesse in S. alba-Blättern zu verstehen, wenn sie Xenobiotika ausgesetzt sind. Die Methode ermöglicht die räumliche Lokalisierung von interessierenden Verbindungen und ihren vorhergesagten Metaboliten in spezifischen, intakten Geweben.

Serie: Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

Massenproduktion von gentechnisch veränderten Aedes aegypti für Feldfreisetzungen in Brasilien

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Forschung

Umwelt

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimieren Rauchgas Einstellungen, um Mikroalgen in Photobioreaktoren Wachstum über Computer-Simulationen fördern

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Messraten von Herbizid Metabolism in DICOT Weeds mit einem herausgeschnittenen Blatt Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS-Analyse von menschlichen Blutplättchen als Plattform für ein Studium Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to inorganic arsenic through diet, information about distribution of arsenic species in various food types must be generated. A method, previously validated in a collaborative trial, has been applied to determine inorganic arsenic in a wide variety of food matrices, covering grains, mushrooms and food of marine origin (31 samples in total). The method is based on detection by flow injection-hydride generation-atomic absorption spectrometry of the iAs selectively extracted into chloroform after digestion of the proteins with concentrated HCl. The method is characterized by a limit of quantification of 10 &#181;g/kg dry weight, which allowed quantification of inorganic arsenic in a large amount of food matrices. Information is provided about performance scores given to results obtained with this method and which were reported by different laboratories in several proficiency tests. The percentage of satisfactory results obtained with the discussed method is higher than that of the results obtained with other analytical approaches.

The usefulness of an analytical method to determine inorganic arsenic in a wide range of food matrices is demonstrated. The method consists of selective extraction of inorganic arsenic into chloroform with a final determination by hydride generation-atomic absorption spectrometry.

Bestimmung von anorganischem Arsen in einer breiten Palette Essen Matrizen mit Metallhydrid-Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Beurteilung der Feinstaub entfernen Fähigkeiten des Baumes Blätter

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The power of their influence is in extraradical mycelia that spread beyond nutrient depletion zones found near roots to ultimately interconnect individuals within a common mycorrhizal network (CMN). Most experiments, however, have investigated the role of AM fungi in plant interactions by growing plants with versus without mycorrhizal fungi, a method that fails to explicitly address the role of CMNs. Here, we propose a method that manipulates CMNs to investigate their role in plant interactions. Our method uses modified containers with conical bottoms with a nylon mesh and/or hydrophobic material covering slotted openings, 15N fertilizer, and a nutrient-poor interstitial sand. CMNs are left either intact between interacting individuals, severed by rotation of containers, or prevented from forming by a solid barrier. Our findings suggest that rotating containers is sufficient to disrupt CMNs and prevent their effects on plant interactions across CMNs. Our approach is advantageous because it mimics aspects of nature, such as seedlings tapping into already established CMNs and the use of a suite of AM fungi that may provide diverse benefits. Although our experiment is limited to investigating plants at the seedling stage, plant interactions across CMNs can be detected using our approach which therefore can be applied to investigate biological questions about the functioning of CMNs in ecosystems.

Most plants within communities likely are interconnected by arbuscular mycorrhizal (AM) fungi, but mediation of plant interactions by them has been investigated primarily by growing plants with versus without mycorrhizas. We present a method to manipulate common mycorrhizal networks among mycorrhizal plants to investigate their consequences for plant interactions.

Untersuchung der Pflanze Interaktionen netzübergreifend gemeinsame Mykorrhiza mit gedrehten Kerne

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The ...

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural losses. To understand the biology of such pest moths, fundamental techniques have been in high demand. Here, methods for mass-rearing, observations, and molecular studies are developed using two tea tortrix, Homona magnanima and Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insects were mass-reared with sliced artificial diet and maintained by inbreeding for over 100 generations by considering their biological characteristics. Insects have various sex dimorphisms; hence it is difficult to distinguish the sex during the developing stages, which have prevented subsequent assays. The present work highlighted that the sex of tortricids larvae could be determined by observing testes or lactic-acetic orcein staining to visualize the female-specific W chromosome. Moreover, using the sex determination methods, the present study enabled nucleic acid extractions from sex determined embryos and application toward high throughput sequencing. These tips are applicable for other pest insects and will facilitate further morphological and genetic studies.

The present protocol describes the rearing method of tortricid pest insects in the laboratories. The procedures to distinguish insects' sex and extract nucleic acids for high throughput sequencing are established using two tortricid pests.

Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...