このプロトコルは、単一細胞レベルでのさまざまな表現型変化を直接観察し、タンパク質の局在化および遺伝子発現タイミングの継続的なモニタリングを可能にする。蛍光顕微鏡の主な利点は、生細胞における細胞分裂や細胞形態変化などの様々な生物学的プロセスを監視するための簡単な方法であるということです。サンプル調製プロトコルに特に注意を払い、このプロトコルに記載されている設定とオプションを見つけることができるように顕微鏡ソフトウェアを探索してください。
このプロトコルの視覚的な表現は、ユーザーが自分の実験を設定する技術の重要なステップを見て学ぶことを可能にするので、重要です。適切な膜染色染料で対象となる細胞培養液の5〜50マイクロリットルのアリコートを標識し、染色された細菌細胞の5マイクロリットルを35ミリリットルガラス底培養皿の底のカバースリップに追加します。直径11ミリメートルのアガローススラブをサンプルの上に置き、そらがカバースリップに対して平らであることを確認するためにそっとタップします。
その後、カバースリップの周りに約5マイクロリットルの水を加えて、アガロースパッドの乾燥を防ぎ、培養皿が高解像度のデコンボリューション顕微鏡のインキュベーションチャンバー内の温度に15〜20分間平衡化できるようにします。サンプルを画像化するには、粗い調整フォーカスノブを使用して、顕微鏡ソフトウェア内で顕微鏡を初期化する前に、目的が完全に低下していることを確認します。100x油浸し目的に1.517屈折率油を入れ、サンプルを含むガラス底皿を金属製の筐体の棺に移します。
皿をステージクランプにそっとスライドさせ、粗い調整ノブを使用して、油が皿のガラス底に接触するまで目的を上げます。接眼レンズと微調整ノブを使用してサンプルをフォーカスし、カメラモードに切り替えます。[3D を解決]ウィンドウのイメージング ソフトウェアで、[設計/実行実験]アイコンを選択します。
新しいダイアログ ボックスが表示されますデザイン/実行実験。ダイアログボックスの「設計」タブと「断面」タブを開き、Z スタックの数とサンプルの厚さを設定します。サンプル内のセルの厚さを測定するには、[3D を解決]ダイアログ ボックスの上下矢印を使用して Z 面を段階的に調整し、セルがイメージ取得の上限と下限としてフォーカスを外れる位置を調整します。
[3D を解決]ダイアログ ボックスで選択した個々のチャネルの光強度のパーセント透過率と露出の持続時間を調整した後、[ポイント リスト]をクリックして[ポイント リスト]を開きます。[デザイン]タブと[タイムラプス]タブで、[タイムラプス]チェックボックスを選択し、タイムラプスパラメータを入力します。[訪問先リスト]オプションを選択し、テキストボックスに、完全なシーケンスの場合はカンマまたはハイフンで区切って、画像化するポイントを入力します。
次に、[実行] タブでファイル名とファイルの場所を編集し、[実験の開始] ダイアログ ボックスで [再生] を選択して実験を開始します。解析の最後に、適切なデコンボリューション プログラムで目的の RAW イメージ ファイルを開き、[プロセス]タブと[デコンボルブ]を選択します。画像を TIFF ファイルとして保存する前に、必要に応じて、任意の波長チャネルまたはすべての波長チャネルで手動バックグラウンドノイズ減算と明るさコントラスト調整を行います。
セル長の定量を行う場合は、製造元が提供するソフトウェアまたは ImageJ などの無料のイメージング ソフトウェアでデコンボリューションされたイメージ ファイルを開き、[ツール] タブを開きます。次に、[距離を計測]を選択し、目的のイメージ ファイルの始点と終点を左クリックして、セルの長さを計測します。蛍光シグナルの定量化の場合は、データ検査を選択します。
[列/行]オプションを特定の寸法に設定したボックスを描画し、定量化する信号のある領域を選択します。GGS 8株を誘導するキシロースの添加は、6細胞表現型をもたらす。空のベクターコントロールは、誘導体の不在で増殖したコントロール細胞に似ているように見えますが。
ステープルアウレウスgpsBの過剰産生は、時間経過顕微鏡と細胞長定量法によって測定されるようにB.subtilisの細胞分裂を破壊する。さらに、FtsZまたはこのタンパク質に関連するタンパク質の1つの局在パターンを、時間経過イメージングおよび細胞長定量を通じて新規の抗菌化合物を研究および/または同定するためにレポーターを使用することができる。画像化に使用する温度によって屈折率が変化する可能性があるため、適切な屈折率を持つ油脂を使用してください。
デコンボリューションは、ユーザーが焦点外のノイズを除去したい場合に行うことができるし、蛍光信号の定量と細胞の長さと幅の測定を含むデータ解析も行うことができます。
