我々はマイケルFeissとファージの作成と精製に関するガイダンスジャンシッピーに感謝しています。我々は、細胞認識ソフトウェア、Schnitzcellを提供するためのマイケルElowitzに感謝します。 、ウェルチ財団（助成Q-1759）とヒューマン·フロンティア·サイエンス：ゴールディングラボの仕事は国立衛生研究所（R01GM082837）、国立科学財団（生きている細胞の物理学研究センター082265、PFC）からの補助金によってサポートされていますプログラム（RGY 2008分の70）。

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

菌株、ファージ及びプラスミド： ひずみLE392はsupFです。それは（詳細については表1を参照）は、ファージゲノム中SAM7突然変異を抑制するために選ばれました。溶菌経路を選択した感染細胞が意志としてこのように、誘導され溶原は、最終的に、ファージ粒子を溶解し、解放します。溶原性細胞は30℃で栽培されている℃のファージゲノム中857アレルCI温度感受性の存在に起因する。熱誘導後、GPD-EYFPおよび野生型GPDは、λLZ1のゲノムおよびプラスミドpPlate * Dのそれぞれから同時発現される。その結果、新たに作成されたλファージLZ2のキャプシドはGPD-EYFPおよびGPDタンパク質の混合物を含んでいます。このモザイクファージは、構造的に安定しており、個々のファージ5の検出を可能にするために十分に蛍光性である。 PP RE - mCherryは溶原pathwaの選択を検出するために使用されるプラスミドレポーターですyである。プロモーターP REは溶原性1,11の確立時にCIIによって活性化される。 PP RE - mCherry 5は mCherry 12でGFPを置き換えることにより、PE-GFP 11から派生したものです。詳細については、当社の以前の仕事5を参照してください。 成長条件パラメータ： 溶原誘導（第1節）の間に、180 rpmで軽度の揺れは良いウイルス収量13を与える。グルコース代謝があるので避けてください成長培地中のグルコースの使用は酸性代謝産物を生成し、成熟したラムダ粒子が酸性pH 13で不安定である。 MgSO 4の加算はファージカプ3を安定させることを目的としている。野生型CI（代わりにCI 857）を運ぶファージは、溶原菌は、DNA損傷剤のマイトマイシンC 3を使用して誘導することができる。ステップ1.3では、37℃でインキュベーション℃は通常90分を超えてはいけません。それは、USEFです<html> 30分ごとにOD 600により細胞密度を確認してUL。良いライセートは、OD 600が約0.2以下に低下し、残りのOD 600が細胞破片の結果です。新しく作成されたファージは、細胞の破片に自分のDNAを注入するために始めることができるから時間が経ちすぎインキュベートすると、下のファージの収率で発生する可能性があります。ステップ2.11と2.13で見えるファージバンド（少なくとも1×10 11ファージ粒子）を取得するには、ステップ1.2で少なくとも500 mlの培養液を栽培しています。ステップ5.1および5.2の増殖培地中に0.2％マルトースの添加は子羊、ラムダファージの吸着3,14に対する受容体の発現を誘導することを目的としている。 mCherry -ステップ5.2の代わりに、100倍1000倍に希釈し、レポータープラスミドのPP REからmCherryのバックグラウンドレベルを減らすことを目的としています。 、35をトリガファージDNA注入のためのステップ5.5°Cでは温度感受性cI857対立の誘発を避けるために選択されます。 ファージ精製： jove_content &quot;&gt;ファージの精製工程（2.11〜ステップ2.1）は、他の精製プロトコル5に置き換えられますが、CsCl平衡勾配（ステップ2.12と2.13）を介して最終的に超遠心分離は不可避であることができます。スイングバケットローターはステップ2.10と2.12で必要とされる鋭い目に見えるファージバンドを確保する。純粋ファージ株式の取得には一週間ほどかかる場合がありますので、中間段階の間に何かがうまくいかないことを確認するための方法に沿ってファージ力価を確認する必要があります。 ファージの取り扱い： 第2節の全精製手順の間に、それはファージは、ファージ頭部からファージ尾部を剪断避けるために穏やかにライセートを処理するために重要です。第5節で細胞感染（例えば、5.7を通じて5.5ステップ）の間に、それはまた、感染細胞からファージ粒子のせん断を避けることが重要です。のIE、ファージのDNAを注入した後、感染細胞から剪断される場合、結果は &quot;暗い&quot;感染症であることに注意してくださいクション結果が実験で観察されたが、感染ファージはしませんされます。ファージまたはファージ/細胞混合物を取り扱うときは、必ずこのような問題の発生を防ぐために、我々は広いピペットチップを使用しています。 DAPIのテスト： DAPI（4節）とファージストックを染色すると、ファージストックの純度を確認するには、迅速かつ効率的な方法です。また、時間をかけて既存のファージストックの分解の可能性をテストするために使用することができます。純粋な株式については、蛍光顕微鏡下でYFPおよびDAPI信号の共局在はほぼ100％であるべきである。我々は通常のYFPスポットの1％未満では、これらの粒子が正常にウイルスDNAをパッケージ化しなかったことを示していたり​​、既に他の場所で彼らのDNAを注入したDAPIを（ウイルスゲノムなしキャプシドを表す）は、含まれていないことを確認します。 DAPIのスポットの1％未満はYFP（非蛍光性のファージに相当）が含まれていません。この条件が満たされない場合、2.14を通じて2.12はoに繰り返されるために必要な手順再び精製するrder。長期的なライブセルイメージングがここに必要としないため、撮像パラメータに関しては、ステップ4.3の顕微鏡のセットアップでは、第5節でほど重要ではありません。 1の願いはただ一つのファージ粒子の蛍光強度を校正する場合は、第5節と同様に顕微鏡の設定を保存しておくことは有用である。 PBS-アガローススラブは非常にきれいで、またはDAPI染料が使用されても過言ではない場合には、ファージDNAに対応するいくつかのDAPIスポットは &quot;ハロ&quot;で囲まれていてもよい。少なすぎるDAPIの染料が使用されている場合は、DAPIのチャネ​​ルからの信号は非常に弱いかもしれません。 顕微鏡システム： 第6節のイメージングのために、私たちは100倍対物レンズ（プランのFluo、開口数1.40、油浸）と標準フィルターセット（ニコン）と、商業倒立落射蛍光顕微鏡（エクリプスTE2000-E、ニコン）を使用します。蛍光光源は、光強度の制御とアーク灯である。次の機能は、コンピュータ制御されています：x、y、zのPOsition、明視野と蛍光シャッター、及び蛍光フィルター選択。オートフォーカス機能が必要です。そうしないと、フォーカスが容易にタイムラプスムービー（通常は4時間長い）の間に流れ出すことがあります。それが並列で複数の感染イベントを追跡することが可能として、各時点で（x、y）は、複数のポジションを獲得する能力は、便利です。我々は一般的に100感染イベントに追従し、それぞれの映画の中で8段階のポジションを獲得。我々が使うカメラは16ビット（Cascade512、Photometrics）のダイナミックレンジを持つ16×16μmのピクセルのカメラと512×512冷却CCDである。買収は、MetaMorphソフトウェア（Molecular Devices）を使用して実行されます。顕微鏡は、恒温室に置かれるべきである、或いは、顕微鏡ステージは、温度制御室で囲む必要があります。 画像取り込み： ライブセルイメージングのために、それは漂白とフォーにつながる可能性があり、試料の不必要な被ばくを避けるために重要ですtotoxicity。したがって、それは最初に漂白過大または細胞増殖を阻害するに至らない間に蛍光を検出することができ、最適な露光量を見つけるためにあなたのシステムを特徴づけるために最善の方法です。良い蛍光画像を得るためには、励起光強度、露光時間とカメラゲインと遊ぶ。ステップ6.2から6.3で、10分のフレーム間隔は、光の露出を最小限に抑えることを目的として選択されます。各フレームでは、単一の合焦画像は、位相コントラスト（細胞認識のために）および蛍光チャネル（細胞の運命を決定するため）が必要である。最初の時点では、しかし、YFPのチャネルを介して、複数のz位置の画像は、細胞表面上のすべての感染したファージをキャプチャする必要があります。初期フレームにおけるYFPの露光時間はまた後で時間枠でタイムラプスムービーで使用しているよりも高くする必要があるかもしれません。 画像解析： 非常に慎重にステップ7.1における細胞表面の周りファージ粒子を数える。として上で述べたように、我々は、ステップ6.2におけるYFPのチャネルを介してZ-スタックのシリーズを取る。しかし、これはまだカウントに挑戦一部の蛍光ファージ粒子アウトフォーカスを離れることができる。最初の時間枠内のセルの長さがMetamorphソフトウェアを使用して測定されています。セル長はまた、ImageJのか、他のソフトウェアツールによって測定することができる。さらに、自動化された家庭MATLAB組み込みプログラムは、そのような細胞系譜に沿って時間をかけて蛍光変化などの情報を取得する際に非常に役立つことがあります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>シグマ</td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ</td><td> R4642〜10mgの</td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SMバッファー</td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td>セシウム</td><td>シグマ</td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td>注射器</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309585 </td></tr><tr><td>針</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 305176 </td></tr><tr><td>透析カセット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 66333 </td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>コー​​ニング</td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti超明確な管</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti超明確な管</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Tiローター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Tiローター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 335649 </td></tr><tr><td>屈折計</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から947 </td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプスTE2000-E </td></tr></tbody></table> 表2試薬と機器。

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

バクテリオファージ（ファージ）ラムダと細菌大腸菌を含むシステム大腸菌は長い細胞運命決定の1,2のためのパラダイムを務めている。ファージの数によって、細胞の同時感染後、2つの経路のものが選ばれる：溶解（強毒性）または溶原（休止状態）3,4。我々は最近、蛍光個々のファージを標識するための方法を開発し、個々のファージとセル5のレベルでは、顕微鏡下でリアルタイムで感染後の決定を調べることができました。ここで、我々は以前の仕事5に記載された感染実験を行うための完全な手順について説明します。これは蛍光ファージの作成、細胞の感染、顕微鏡下でのイメージングおよびデータ分析が含まれています。蛍光ファージは、カプシドGPDタンパク質の &quot;ハイブリッド&quot;、共発現する野生型およびYFP融合バージョンです。原油ファージ溶菌液は最初GPD-EYFP（ENHの溶原菌を誘導することによって得られるプラスミドを発現する野生型GPDを宿す、黄色蛍光タンパク質）ファージをとれた。精製工程のシリーズは、その後、顕微鏡下でのDAPI標識やイメージング、続いて行われます。これは、均一性、DNAパッケージング効率、蛍光シグナル及びファージストックの構造安定性を確認するために行われます。細菌にファージの初期吸着は、その後、35℃で短時間のインキュベーションに続いて、氷の上で実行される°Cは、ウイルスDNA注入6をトリガする。ファージ/細菌混合物を、次いで、薄い栄養寒天平板の表面に移動したカバーガラスで覆われており、落射蛍光顕微鏡下で撮像される。感染後の処理は10分間隔で、4時間続きます。複数のステージの位置は約100細胞の感染は、単一の実験でトレースすることができるように追跡されます。それぞれの位置と時間の時点で、画像は位相コントラストと赤と緑の蛍光チャネルで取得されています。位相コントラスト画像は、自動化されたセルのために後で使用されている新しい蛍光ファージの生産（緑）細胞溶解、または再開細胞の増殖と分裂に続いて溶原性因子の発現（赤色）が続いています。蛍光チャンネルが感染の転帰を特徴付けるために使用されるのに対し、Lは認識。取得したタイムラプスムービーは、手動と自動の方法を組み合わせて使用​​して処理されます。各感染事象（感染ファージの例数と位置）だけでなく、感染症の転帰（溶解/溶原性）のための感染パラメータの同定におけるデータ解析結果。必要に応じて追加のパラメータを抽出することができる。

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します<em&gt; E大腸菌の</em&gt;細菌、顕微鏡下での感染の結果に続く、感染結果の分析。

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.0K ビュー.  University of Illinois at Urbana-Champaign. この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します E大腸菌の細菌、顕微鏡下での感染の結果に続く、感染結果の分析。