本研究は、文部科学省(18K04843)からY.八幡、JST ERATO(JPMJER1502)から野村への科学研究助成によって支えられた。

1. サンプルの調製
<ol><li>グラススライドに、厚さ1mmのシリコーンガスケットとウェルを置きます。</li>
	<li>シリコーンガスケットのウェルに厚さ0.8%(w/v)のアガローススラブを1mm入れる。</li>
	<li>任意の微生物細胞培養物の細胞密度を600 nm(OD660)=1.0の光学密度に希釈します。</li>
	<li>アガローススラブに5μLの細胞懸濁液を置きます。</li>
	<li>ガラスカバースリップでやさしく覆います。</li>
</ol>2. 顕微鏡のセットアップ
注意:CRIF技術は、共焦点反射顕微鏡(CRM)と多チャンネル共焦点顕微鏡を組み合わせたものです。CRMは、細胞の自然な蛍光から独立している細胞形態と空間局在化のための情報源として機能します。多チャンネル共焦点顕微鏡は、細胞の自然蛍光のスペクトル情報を提供します。以下のプロトコルにおいて、CRMまたは共焦点蛍光顕微鏡で取得した任意の画像は、それぞれCRM画像または多チャネル共焦点顕微鏡画像と呼ばれる。
<ol><li>反射スペクトルチャンネルを持つ共焦点顕微鏡を、光増倍管(PMT)またはGaAsP検出器に接続します。 注: これらの設定は、いくつかの製造元から入手できます。</li>
	<li>顕微鏡に十分な倍率を持つ高い数値開口(NA)の目的を装備します。 注: 細菌細胞の解析には、NA > 1.4 の 63x の目的が推奨されます。</li>
	<li>細胞の形態を可視化するために入射光の細胞散乱に依存するCRMに対応するために、半反射ミラー(例えば、NT 80/20)を顕微鏡に装備します。</li>
	<li>多チャンネル共焦点顕微鏡では、顕微鏡に二色性ミラーを装備します。たとえば、405、458、488、488、488、514、543、または633 nmのexの場合は、MBS InVis405、MBS458、MBS458/514、MBS488/543/513、またはMBS 488/543/633ビームスプリッターを使用します。</li>
	<li>レーザーパワーメーターを使用して、励起波長ごとに照明強度を調整します。励起波長を通して一定の顕微鏡の下で出力を保つ(例えば、63xの目的で50 μWを使用)。</li>
</ol>3. 画像取得
<ol><li>顕微鏡ソフトを使用してピンホールサイズを1 AUに設定します。</li>
	<li>各励起波長のピクセルのドウェル時間(すなわち、走査速度)を設定します。 注: ピクセルの長い時間が長すぎると、セルに損傷を与える可能性があります。細胞への光の損傷を最小限に抑えるために、過度に長いピクセルのドウェル時間を避けてください。細菌サンプルの場合、ピクセルドウェルタイム<55.6 μs/μm2 (顕微鏡下での放射出力が〜17μW/cm2の場合)は、通常、増殖阻害を避けるために適しています。このパラメータは、生物や実験の設定によって異なる場合があります。</li>
	<li>スキャンの解像度を設定します。細菌などの小さな細胞の場合は、1,024 x 1,024のスキャンエリアを使用してください。</li>
	<li>対象領域がカバーされるように Z スキャン範囲を設定します。 注:アガローススラブに分布する細菌および酵母細胞サンプルの場合、Zスキャン範囲は通常〜15μmで十分です。</li>
	<li>スキャン解除された検出器を設定して、可視波長範囲(例:416~691 nm)をキャプチャします。8-10 nm のスペクトル ウィンドウを使用します。</li>
	<li>蛍光画像のZスタックを作成するために、長いから最短の励起波長までのシーケンスで多チャンネル共焦点顕微鏡画像を取得します。</li>
	<li>CRMイメージを取得します。</li>
	<li>取得したイメージを 16 ビットの TIFF ファイルとしてディレクトリに保存します。名前付け規則 XXXcYYzZZ を使用してファイルに名前を付けます.tif XXX は励起波長、YY は検出チャネル番号、ZZ は Z スライス番号、"c"と "z" はそれぞれ検出番号と Z スライス番号のプレフィックスです。<ol>
<li>例えば、多チャンネル共焦点顕微鏡画像が励起波長405nmで撮影された場合、検出器アレイの第1検出器チャネル、およびZスタックの第5のスライスである場合、その名前は「405c01z05.tif。CRM イメージの場合は、XXX の代わりに文字列 "CRM" を使用します ("CRMc01z05.tifなど)。 注: 2D または 3D セグメンテーションが画像データに最適かどうかを決定します。小さな細胞が2D平面に拘束される状況(例えば、ガラス表面に付着した細菌集団)で、2Dセグメンテーション法を使用します。細胞集団が3次元空間(例えば、バイオフィルムおよび組織サンプル)に分布している場合、または細胞サイズが光学スライスの厚さ(例えば、酵母細胞、哺乳類細胞)よりも大きい場合には、3Dセグメンテーション法を使用する。2D セグメンテーションについては、セクション 4 を参照してください。3D セグメンテーションについては、セクション 5 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 2D画像解析
<ol><li>ワークステーションに画像解析ソフトウェア(MATLABなど)を装備します。</li>
	<li>単細胞の自然蛍光シグネチャの細胞のセグメンテーションと再構築を行います。<ol>
<li>画像解析ソフトウェアを開きます。</li>
		<li>表示されているスクリプトの 1 つをダブルクリックして開きます "Script2D.m" 。</li>
		<li>[エディタ] タブに移動し、[実行] をクリックします。フォルダ選択ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>ステップ 3.8 で作成したディレクトリを選択し、[ 開く ] をクリックして続行します。セグメンテーション パラメータの入力を求めるダイアログ ボックスが自動的に表示されます。 注: テスト目的で、提供されたデータセット (「Sample_2D」) を選択します。サンプル データセットは圧縮ファイルとして提供され、事前に抽出する必要があります。</li>
		<li>セグメンテーション パラメータを入力します: イメージ 二値化のしきい値 ( 0.45)、 セル領域の上限しきい値 (ピクセル単位) = 200、 セル領域の下限 (ピクセル単位) = 10、 検出器の数 = 32。[ OK] を クリックして続行します。 注: これらのパラメータは、画質に応じて調整が必要な場合があります。</li>
		<li>CRM イメージを表示する新しいイメージ ウィンドウが表示されます。背景の減算に使用する任意の背景領域 (セルが存在しない領域) を選択します。CRM イメージ内の四角形をマウスでドラッグして描画します。選択した領域内をダブルクリックして、選択を確定します。</li>
		<li>手順 4.2.4 で選択した同じディレクトリで Signature という名前の新しいディレクトリを見つけます。 注: 指定されたコードは、このディレクトリを自動的に作成します。「署名」ディレクトリは、一般的な接頭辞「署名」の後に連続して番号が付.pngファイルとして、集団内の各微生物細胞の自然蛍光シグネチャを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.3D画像解析
<ol><li>ワークステーションに画像解析ソフトウェア(材料表)を装備します。</li>
	<li>単細胞の自然蛍光シグネチャの細胞のセグメンテーションと再構築を行います。<ol>
<li>画像解析ソフトウェアを開きます。</li>
		<li>ダブルクリックして、提供されているスクリプト "Script3D.m" を開きます。</li>
		<li>[エディタ] タブに移動し、[実行] をクリックします。フォルダ選択ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>ステップ 3.8 で作成したディレクトリを選択し、[ 開く ] をクリックして続行します。セグメンテーション パラメータの入力を求めるダイアログ ボックスが自動的に表示されます。 注: テスト目的で、提供されたデータセット (「Sample_3D」) を選択します。サンプル データセットは圧縮ファイルとして提供され、事前に抽出する必要があります。</li>
		<li>セグメンテーション パラメータを入力: イメージ 二値化のしきい値 (0 –1) のイメージ の二値化 = 0.01、 セル体積の上限しきい値(ピクセル数)=1,000、セル領域の下限しきい値(ピクセル単位)=20、Xピクセルサイズ[μm/ピクセル]=0.26、Yピクセルサイズ[μm/pixel]=0.26、Zピクセルサイズ[μm/ピクセル]=0.42、検出器数= 32。[OK] をクリックして続行します。励起波長の数の入力を促すダイアログボックスが表示されます。 注: これらのパラメータは、画質に応じて調整が必要な場合があります。</li>
		<li>画像取得に使用する波長数を入力します(例えば、405、488、561、630を使用する場合は、ダイアログボックスに 4 と入力します)。[ OK] をクリックします。</li>
		<li>最短(すなわち、ボックス名: 励起番号1)から最長波長までのシーケンスで励起波長を入力して、ダイアログボックスに入れます。[ OK] を クリックして続行します。CRM イメージを表示する新しいイメージ ウィンドウがポップアップ表示されます。</li>
		<li>背景の減算に使用する任意の背景領域(つまり、セルが存在しない領域)を選択します。CRM イメージ内の四角形をマウスでドラッグして描画します。選択した領域内をダブルクリックして、選択を確定します。</li>
		<li>手順 5.2.4 で選択したディレクトリで 、Signature という名前のディレクトリを見つけます。 注: 指定されたコードは、このディレクトリを自動的に作成します。「署名」ディレクトリは、一般的な接頭辞「署名」の後に連続番号が付いた.pngファイルとして、集団内の各単一の微生物細胞の自然蛍光シグネチャを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 統計分析
注:細胞集団のハイパースペクトルの分布を可視化するために、寸法縮小技術(例えば、主成分分析[PCA])を行います。提供されたスクリプト(PCA.py)は、2つのセル集団(すなわち、2つのクラス)に対してPCAを実行する。
<ol><li>ワークステーションにプログラミング言語と付属のライブラリとモジュールを装備します (資料表)。</li>
	<li>C ドライブ (またはそれと同等) に空のディレクトリを作成し、ディレクトリに 「Parent_directory」という名前を付けます (C:/Parent_ディレクトリ)。</li>
	<li>2つの細胞集団のそれぞれについて、2つの細胞集団の蛍光シグネチャ(例えば、ステップ4.2.7で生成された.pngファイル)を2つの別々のディレクトリに格納します。 注: 2 つのディレクトリは両方とも "Parent_directory" に配置する必要があります。 C:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">プティダKT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signature01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">シグネチャー02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">プティダKT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signature01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">シグネチャー02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>PCA.py を「Parent_directory」にダウンロードします。</li>
	<li>ワークステーションのコマンド・ライン・インターフェースを開きます。</li>
	<li>コマンドラインインターフェイスに「python C:/Parent_directory/PCA.py」と入力します。</li>
	<li>「対象ディレクトリの選択」というメッセージが表示されたら、「Parent_directory」を選択します。</li>
	<li>「C:/Parent_directory」で、結果として得られるPCAプロットを含む「PCA.png」を見つけます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metabolomics.">Microbial metabolomics.</a> Current Genomics. 12, 391-403 (2011).</li><li>Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Then+and+now:+use+of+16S+rDNA+gene+sequencing+for+bacterial+identification+and+discovery+of+novel+bacteria+in+clinical+microbiology+laboratories.">Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories.</a> Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).</li><li>Amman, R., Fuchs, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+identification+in+microbial+communities+by+improved+fluorescence+in+situ+hybridization+techniques.">Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques.</a> Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).</li><li>Giana, H. E., Silveira, L., Z&#226;ngaro, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacterial+species+by+fluorescence+spectroscopy+and+classification+through+principal+components+analysis.">Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis.</a> Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).</li><li>Leblanc, L., Dufour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+identity+of+bacteria+using+their+intrinsic+fluorescence.">Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence.</a> FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).</li><li>Hou, X., Liu, S., Feng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autofluorescence+characteristics+of+bacterial+intracellular+and+extracellular+substances+during+the+operation+of+anammox+reactor.">The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor.</a> Scientific Reports. 7, 39289 (2017).</li><li>Ramanujam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+diagnosis+of+cervical+intraepithelial+neoplasia+using+337-nm-excited+laser-induced+fluorescence.">In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence.</a> Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).</li><li>Zhang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+cellular+fluorescence+reflects+alterations+in+cellular+proliferation.">Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).</li><li>Gosnell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+non-invasive+cell+characterisation+and+discrimination+based+on+multispectral+autofluorescence+features.">Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features.</a> Scientific Reports. 6, 23453 (2016).</li><li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interspecies+variability+of+single-cell+innate+fluorescence+signature+of+microbial+cell.">Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).</li><li>Nelson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+and+comparative+analysis+of+the+metabolically+versatile+Pseudomonas+putida+KT2440.">Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).</li><li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range,+high+copy+number,+RSF1010-derived+vectors,+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas.">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li><li>Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+analysis+of+DNA-binding+proteins+by+yeast+one-hybrid+and+one-two-hybrid+systems.">Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems.</a> Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).</li><li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+biofilm+development+in+a+microfluidic+device+using+modified+confocal+reflection+microscopy.">Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).</li><li>Lakowicz, J. 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C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+spectroscopy+and+imaging:+A+tool+for+biomedical+research+and+diagnosis.">Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

再現性のある結果を得るために密接に従う必要があるこの方法の2つの重要なポイントがあります:1)励起波長と実験を通じて顕微鏡目的の下でレーザー出力を一貫して保ち、2)正確な細胞セグメンテーションを行います。
最初の点は、異なる実験間で自然蛍光シグネチャを比較する際に特に重要です。最大出力出力はレーザーライン間で大きさが大きく異なる場合がある?...

セル1内の多様な生体分子は自己蛍光シグナルを放出し、細胞の自然蛍光シグネチャはこれらのシグナルの集合体から成る。このシグネチャー蛍光は、様々な細胞特性および生理学的状態の違いを反映しています。自然な蛍光の分析は、低侵襲であり、完全な細胞破壊に軽度の代謝修飾から痕跡の範囲を残す伝統的な、より侵襲的な微生物学的プローブを補完することができます。DNAや細胞内容抽出2,3、蛍光インストハイブリゼーション4、および蛍光レポーター遺伝子のゲノムへの導入は、細胞の種類や生理学的状態の決定に有効であるが、一般的には細胞の操作または侵襲的なタグ付けのいずれかが必要である。
バルク微生物培養懸濁液5,6、活性汚泥7、哺乳動物組織8,9、および哺乳動物細胞1,10を含む様々な生きた微生物コロニーの自然な蛍光の研究は、自然な蛍光分析が細胞型および生理学的状態のタグフリー分析を促進することを示した。自然蛍光シグネチャは、従来、単細胞レベルではなく集団レベルで分析されてきたため、クローン培養が必要です。これに対し、このコンフォーカル・レンレクシス法は、コンフォーカル・レンレクシス法を支援する単細胞中華離性の分析(CRIF)技術111を、個々の生きた微生物細胞の自然な細胞蛍光シグネチャを再構成およびカタログ化する。さらに、CRIFは、3次元(3D)空間に分布する集団内の単一の微生物細胞の自然蛍光シグネチャを体系的に照合することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agarose</td>
			<td style="width:220px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">312-01193</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Beam splitters</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cover slips</td>
			<td style="width:220px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C024601</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass slides</td>
			<td style="width:220px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S011120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Half-reflection mirror</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NT80/20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Laser power meter</td>
			<td style="width:220px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">PM400 (power meter console) and S175C (sensor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LB Broth</td>
			<td style="width:220px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">20066-95</td>
			<td>For bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:220px;">The MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Microscope objective</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;">440762-9904</td>
			<td style="width:167px;">e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope software</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PBS(-)</td>
			<td style="width:220px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">166-23555</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:215px;">Programming language</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Silicone gasket</td>
			<td style="width:220px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P24744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Workstation</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1500-250G</td>
			<td>For yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">YPD medium</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstruction of single-cell innate fluorescence signatures by confocal microscopy

ここで説明するのは、共焦点反射顕微鏡支援単一細胞自然蛍光分析(CRIF)であり、3次元(3D)空間に分布する集団内の各個体の生細胞からの自然な細胞蛍光シグネチャを再構築するための低侵襲的な方法である。細胞の自然蛍光シグネチャは、細胞内の様々な生体分子によって放出される蛍光シグナルの集合体です。これまでの研究では、自然蛍光シグネチャは、様々な細胞特性と生理学的状態の違いを反映し、細胞の特性評価と同定のための豊富な情報源であることを確立しました。自然蛍光シグネチャは、伝統的に母集団レベルで分析されてきたが、単細胞レベルではクローン培養を必要としない。CRIFは、個々の細胞からの蛍光シグナルの3D分解能および/または選択的抽出を必要とする研究に特に適しています。蛍光シグネチャは細胞の自然な性質であるため、CRIFは、無傷および単一細胞のタイプおよび/または生理学的状態のタグフリー予測にも適しています。この方法は、異種集団における各単一細胞の表現型を、細胞タグ付けなしで顕微鏡下で自己蛍光シグネチャによって直接評価することができる、合理化された細胞分析のための強力なツールであり得る。

図1Aは 、従来のスペクトルプロット(上)およびヒートマップ(中央)として提示される細菌細胞の典型的な単細胞蛍光シグネチャを示す。 図1B は、土壌細菌の集団の元のCRM画像に重ね合わせた正確な2D細胞セグメンテーションの結果を示す(シュードモナスプチダ KT2440)12。結果として生じる母集団の自然蛍光シグネチャは <stron...

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Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

ここでは、3次元空間に分布する全ての個々の生細胞から自然な細胞蛍光シグネチャ(すなわち細胞自家蛍光)を光学的に抽出およびカタログするためのプロトコルが提示される。この方法は、細菌、真菌、酵母、植物、および動物からの細胞を含む単一細胞分解能で、多様な生物学的系の自然蛍光シグネチャを研究するのに適しています。

共焦点顕微鏡による単細胞自然蛍光シグネチャの再構築

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

2.7K ビュー.  University of Tsukuba. ここでは、3次元空間に分布する全ての個々の生細胞から自然な細胞蛍光シグネチャ(すなわち細胞自家蛍光)を光学的に抽出およびカタログするためのプロトコルが提示される。この方法は、細菌、真菌、酵母、植物、および動物からの細胞を含む単一細胞分解能で、多様な生物学的系の自然蛍光シグネチャを研究するのに適しています。

ビデオ: Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...