分子動態シミュレーションは、分子運動を探索するために使用できる計算技術であり、生化学的および細胞機能を理解するために重要な立体構造の変化を明らかにすることができる。高分子にアクセスできる動的運動の範囲を探査することは困難である。分子動的シミュレーションの結果を実験データと組み合わせて使用することで、その機能の重要性を評価できます。
がん患者に認められた変異がEGFR標的化の確認とリガンド結合に及ぼす影響を、分子動的シミュレーションを用いて実証します。野生型アポ活性EGFRのキナーゼ構造を準備するには、Kymera視覚化プログラムを開き、ファイルメニューの下で[IDでフェッチ]をクリックします。不足している構造2GS2要素を構築するには、他のEGFR構造からこれらのセグメントを取得します。
5残基のグルタミン酸746をEGFRでアラニン750 ELREA欠失に構築し、お気に入り、配列、および野生型2GS2配列を開く示し配列をクリックする。そして、結果のシーケンスウィンドウで、編集をクリックし、シーケンスを追加して、削除ミュータント FASTA 形式シーケンスを選択します。整列ウィンドウで、構造とモデルまたは相同性を選択します。
ポップアップウィンドウで、2GS2複合構造をテンプレートとして指定し、モデル化するクエリーとしてミュータントシーケンスを指定し、zDOPE スコアと目視検査に基づいて、生成されたモデルから変異モデルを選択します。野生型アポ非活性EGFRキナーゼ構造を調製するために、タンパク質データバンク構造2GS7を開き、他のEGFR構造から欠損セグメントを追加して、示されるように欠失変異体形態をモデル化する。ATP結合野生型活性EGFRキナーゼ構造を調製するには、タンパク質データバンク構造2ITXを原理構造として使用し、他のEGFR構造を用いて欠損セグメントを構築し、モデラーを使用して欠失変異体形態をモデリングする。
野生型EGFR非対称ダイマー構造を構築するには、Kymeraで2GS2を開き、ツール、高次構造、およびユニットセルを開き、非対称配置でアクチベーターとレシーバーキナーゼを含む生物学的アセンブリに構造を変換する。2GS2構造を選択して、コピーを作成して入力し、対称操作から得られたダイマーの複数コピーから単一の非対称ダイマーを選択して保存します。アラニン702バリン変異体を構築するには、アラニン702をバリンに置き換えるツール、構造編集、およびロータマーを選択する。
Maestroで構造を開き、タンパク質調製ウィザードボタンをクリックし、水素原子を追加し、不足している側鎖原子を充填し、プレプロセスをクリックします。pH 7.0でイオン化可能な残基のプロトンネーション状態を決定するには、PROPKAをクリックして、水素結合のためのアスパラギン、グルタミン、ヒスタミン残基の向きを最適化し、構造を最小限に抑えます。シミュレーションシステムを設定するには、LEAPプログラムを開き、アンバーFF14SB力場とTIP3P水分子をインポートします。
ATP バインド システムの場合は、ATP のパラメータをインポートし、構造をロードします。タンパク質の表面原子から全方向に10オングストロームを拡張する明示的なTIP3P水分子を持つ八面体ボックス内の構造をソルベートします。ベルトシステムをチェックし、それを中和するために必要なイオンを追加します。
生体分子系を十分にモデル化するには、さらにナトリウムと塩化物の原子をシミュレーションボックスに追加して、システムの塩濃度を0.15モルにし、次に、システムのトポロジと座標ファイルを生成して保存し、その後の生産シミュレーションの入力として機能させます。アンバーを使用すると、最初のエネルギーは、好ましくない構成を回避するためにシミュレーションシステムを最小化します。最小化入力ファイルで、最小最小化サイクルの最大サイクル変数とサイクル数を調整して、最も急な降下アルゴリズムのサイクル数を示します。
拘束マスク パラメータで指定された溶質原子に拘束力を適用するには、拘束ウェイト変数を使用します。複数のステップで最小化を実行し、溶質原子に適用される拘束をモルオングストロームの正方形あたり25から0キロカロリーに徐々に下げ、そのコマンドを使用して最小化を実行します。0から300ケルビンまでの100ピコ秒のシステムを加熱し、溶質原子に正方形のオングストロームの拘束あたり10キロカロリーモルを設定するコマンドを使用します。
その後、加熱を行うためにコマンドを使用します。等熱等圧アンサンブルの下で900ピコ秒のシステムを平衡化し、長距離静電相互作用のために9つのオングストローム距離カットオフを設定し、溶質原子拘束をモルオングストローム四方あたり0.1キロカロリーに徐々に下げ、拘束されていない5ナノ秒のシミュレーションで平衡を確定します。指定されたコマンドを使用してイコライゼーションを実行します。
10 ピコ秒ごとに保存される立体構造で 100 ナノ秒の生産シミュレーションを実行できるようにテキストを調整し、指示に示されたコマンドでシミュレーションを実行します。野生型および変異型の EGFR キナーゼシミュレーション中に立体構造サンプルを視覚化するには、アンバートポロジ ファイルと対応する軌道ファイルを Visual Molecular Dynamics で開きます。便利な二次構造表現を用いて、記録された軌道からタンパク質の全体的な構造ダイナミクスを解析する。
次に、触媒的に本質的なリジン745-グルタミン酸762塩架橋などの原子と目的の残基との間の特定の相互作用を見る。あるいは、シミュレーション中にサンプリングした複数の立体構造をプロテインデータバンク形式で保存し、Kymeraで立体構造を開きます。マッチメーカーオプションを使用して、初期構造または中央値構造に構造を重ね合わせ、中央値構造をソリッドで表示し、残りの位置合わせ構造を色あせた白色で表示することで、記録された構造の動きを見やすく表示できます。
野生型および変異型の EGGFR のグローバル安定性を分析し、さまざまな構造単位の柔軟性を調べるには、アンバーの類型と対応する軌道ファイルをインポートします。二乗平均平方偏差入力ファイルでは、初期構造のバックボーン原子を、二乗平均平方継手の基準として示します。平方平方根の入力ファイルで、初期構造のC-α原子を、二乗平均平方継手の基準として示します。
次に、CPPTRAJ プログラムを使用して分析を実行し、出力データをプロットします。また、立体構造アンサンブルを整列させ、C-α原子の平均平方偏差に基づいて各残基を色付けするには、Kymeraで立体構造を開き、マッチメーカーオプションに合わせます。ツール、描写、および属性によるレンダリングを選択します。
立体構造アンサンブルの残基を選択し、C-αの二乗平均平方偏差を属性として設定し、[OK]をクリックします。立体構造の鎖跡は、それぞれ高、中、低構造安定性の領域を反映して青色、白色、または赤色になります。ATP と野生型および削除 EGfr の間の水素結合相互作用を分析するには、CPPTRAJ スクリプトを用意してこの作業を実行します。分子間水素結合の分析をノイントラモル変数でのみ指定し、ドナーアクセクサ距離が3.5オングストローム以下、結合角が135度以上の水素結合を定義します。
分子内相互作用を評価するには、例えば、触媒的に重要なリジンとグルタミン酸残基の間で、リジンを水素供与剤として指定し、グルタミン酸をアクセプター残基として指定し、その結果の分析を可能にするように示されたスクリプトを実行する。ATPと野生型と欠失性EGFRの間の結合自由エネルギーを計算するには、LEAPプログラムで気相リガンド受容体およびリガンド受容体複合体タンパク質データバンクファイルを調製し、ATPをリガンド、EGFRを受容体として設定します。一般化された生まれの無線値をMボンドI2に設定します。次に、オレンジ色のトポロジを生成し、ガス相のタンパク質データバンクファイルの座標ファイルを作成します。
同様に、野生型とアラニン702バリンEGRSのアクチベーターキナーゼとレシーバキナーゼとの間の結合自由エネルギーを計算するために、レセプターとしてリガンドとアクチベータキナーゼとして受信機キナーゼを指定し、対応するトポロジと座標ファイルを保存する。分子力学を一般化した生まれた表面積入力ファイルを準備し、IGB 値を 2 に、saltcon を 0.1 に設定します。その後、mmpbsaを使用します。
amber で使用可能な py スクリプトは、示されたとおりにコマンドを入力して、バインディングエネルギー計算を実行し、出力データを分析します。この代表的な100ナノ秒のシミュレーションの間に、アラニン702バリン変異体は、野生型EGFRと比較してより緊密な疎水性相互作用による可能性が高い並膜Bセグメントの立体構造安定性の増加を示した。アラニン702バリン変異体はまた、野生型EGFRに対するアクチベーターとレシーバキナーゼ間の結合のより低い自由エネルギーを示し、活性EGFRキナーゼの立体構造を維持するより良好な二量体相互作用を表す。
欠失変異のシミュレーションは、野生型EGFRと比較して機能的にキーαC-らせんのC-α原子変動が低くなり、EGFR活性状態の時間を延長した。また、欠失変異は、リジン745とグルタミン酸762の側鎖極性原子との間に頻繁に水素結合を形成することとなり、野生型EGFRと比較してEGFR酵素活性の重要な相互作用であった。さらに、野生型EGFRに比べて、ATPとEGFR間の水素結合数が欠失変異体に対して大きかった。
また、欠失変異は、EGFR不活性状態αC-helixの内向きの動きをもたらし、活性状態への移行中に予想される構造的変化である。対照的に、野生型不活性EGFRのαCヘリックスは、その初期の立体構造を維持した。突然変異の影響を評価するには、構造の適切な立体構造状態を選択し、これらの構造を適切に準備し、平衡化することが重要です。
これらの技術間の相乗効果が結果の解釈に役立ち、追加のウェットラボ実験を知らせることができるので、分子動的シミュレーションと実験研究を組み合わせることが重要です。
