We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

<ol>
	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li><li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution.">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy:+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells.">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy.">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li><li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology.">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li><li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li><li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts.">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li><li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib.">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li><li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding.">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li><li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+organization+of+ErbB+receptors:+insights+from+microscopy.">The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).</li><li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li><li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+STEM:+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase.">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li><li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li><li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes.">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots.">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+ERBB+receptors:+Multiple+layers+of+diversity+and+control.">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li><li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography.">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li><li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+topography+of+membrane+receptors+and+signaling+molecules+from+spatial+patterns+obtained+using+nanometer-scale+electron-dense+probes+and+electron+microscopy.">Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy.</a> Micron. 37, 14-34 (2006).</li><li>Pinto da Silva, P., Kan, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-fracture:+a+method+for+high+resolution+labeling+of+cell+surfaces.">Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces.</a> J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).</li><li>Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

全細胞におけるこのようなEGFRなどの膜タンパク質の空間分布と化学量論を、学ぶこと、その機能と11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。これは、直接情報がセルまたはセル15の間の差異におけるタンパク質の局在化について失われるために一般的に使用される生化学的方法を用いて、細胞内レベルでのモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を研究するために挑戦しています。その化学量論は、個々の、無傷細胞4-7のコンテキスト内で研究することができるように、ここに記載の標識及び顕微鏡検査方法は、数ナノメートルの長さスケールでのタンパク質複合体の可視化を可能にします。その解像度はタンパク質複合体に従事した分子を区別するのに不十分であるため、これは（超解像度）光学顕微鏡23では不可能です。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、&lt;アンサンブル平均化技術であります&gt; 24 SUP、必ずしもエネルギー移動25の短距離の結果として二量体およびより高次のクラスタを検出しません。近接ライゲーションアッセイ26は、実際の距離を測定しないため、高タンパク質濃度での細胞領域との間を区別することができない、必然的に類似のタンパク質濃度での細胞の領域から、偶然によって検出された近接の数につながるが、タンパク質を含みますかラベルの間に明確な距離を示す複合体。タンパク質複合体の成分を可視化するために必要な高解像度透過型電子顕微鏡（TEM）によって達成されます。しかし、細胞全体の従来のTEMは、原形質膜27、または形質膜リッピングを通してスライス又は膜のランダムに形成された小片の結果28,29を切り離す薄いサンプル/セクションの要件によって制限されます。細胞膜は、このように欠如につながる、全体として撮像されていません可能性が極めて重要な細胞のコンテキスト情報。 細胞におけるタンパク質の化学量論の研究のための他の実験的な課題は、印加されるタンパク質標識から生じます。一般的に使用される免疫標識は、受容体と標識との間の一対一の化学量論は、唯一の一価のプローブを用いて達成され得ることが困難に耐えます。これは、一次および二次抗体が必要とされている場合ではありません。タンパク質の化学量論についての情報を得るためには、プローブは、受容体上のエピトープに固有に結合し、蛍光プローブまたは他の側の高原子番号のナノ粒子のための1つの結合部位を有することが要求されます。近隣の単一タンパク質、ホモ二量体、またはより大きなクラスタ間の差別は、少なくともではないEGFRファミリーの受容体について、現実的ではありませんように、第二に、抗体標識で達成可能な精度は、その大きなサイズ30〜30ナノメートルのアカウントに制限されています。はるかに小さい特定のラベルは、文献およびCAで知られていますnは細胞内標識の31に対しても適用されるが、これらは一般的に使用されていません。全ラベル（EGF-ビオチン - ストレプトアビジンQD）の長さは、EGFRと同様の寸法のものであり、二量体を検出することができるように十分に小さいです。また、記載される二段階標識手順は、標識誘導される受容体のクラスタリングを回避します。 我々の方法は、標識されたタンパク質の蛍光顕微鏡よりもはるかに多く、非常に困難ではないではありません。ステップ数が合算とのいずれかの手順に誤りが実験で完全な故障につながる可能性があるのでしかし、実験では、細心の注意を払って行う必要があります。マイクロチップの取り扱いをお勧めしますTEMグリッドが、いくつかの訓練の空のチップの取り扱いよりも面倒ではありません。全体の水和細胞のESEM-STEMは、おそらく最も困難な側面であり、量子ドットを視覚化するために、必要に応じて3ナノメートルの周りの解像度に到達するために、少なくとも熟練したオペレータと実践の数日を必要とします。放射線ダム調査対象の試料の年齢はリスクを提示します。圧力及び温度は、慎重に水層を維持するために監視されるべきです。また、水の層の厚さは、セル間で変化してもよいです。他の場所で6記載のように、試料上の気体電子検出器を用いて水層の存在を監視することが望ましいです。細胞領域のみが損傷を避けるために一度か二度画像化されるべきです。 この方法の主要な制限は、超微細構造に関する高解像度情報が存在しないことです。他の技術は、例えば、クライオTEMのために、タンパク質の構造、および細胞の超微細構造15を研究するために必要とされます。第二に、タイムラプス顕微鏡で生細胞内のタンパク質の複数の動的相互作用を研究することは、放射線損傷のアカウントでは不可能である、と最先端の光学顕微鏡23を必要とします 。現在、私たちの方法は、L以来、二量体の絶対的なレベルを決定することはできませんabeling効率は不明であるが、我々は将来的にこのようなデータを追加する予定です。これは、二量体が存在しているかどう伝えるためにもかかわらず可能です。文献からは15％程度であっても標識効率は十分な統計的有意性32との二量体を検出するのに十分であることが知られています。 これは、特異的抗体のビオチニル化Fab断片を介して、それらのリガンドを介して他の膜結合型受容体を研究するために容易に可能であるか、または記載される二段階標識化プロトコルを使用して、他の小さなリンカーを介して、7。すでにQDの2つの異なる色（サイズ）を使用することができ、金ナノ粒子標識前ワーク 6に使用したことが実証されているので、同じ実験内の複数のタンパク質種を標識することが可能と思われます。複数のタンパク質種の化学量論の研究のための重要な課題は、尊敬に得られる相対的化学量論の正規化の両種または少なくとも類似の標識効率を確保していますラベリング効率をアイブ。しかし、この研究で使用される2つの異なるQDは、（ 図2および図4を参照）標識効率に大差がないようです。量子ドットとの二段階標識、および蛍光相関顕微鏡およびESEM-STEMを含む記載された方法は、全細胞の無傷の原形質膜に膜タンパク質の複雑な相互作用を研究するための実行可能な方法を提供します。

新しいアプローチは、STEM 1-3、または相関蛍光顕微鏡およびSTEM 4-7を用いて、液体の状態で標識したタンパク質を用いて画像全体の細胞に、最近導入されました。この方法は、全細胞の無傷の原形質膜における単一分子レベルでそれらの化学量論を含む膜タンパク質およびタンパク質複合体の空間分布を研究することが可能です。ここでは、蛍光量子ドット（QD）8、および相関光顕微鏡およびESEM-STEMと受容体タンパク質の二段階特異的な標識を含むプロトコルを記述します。例として、EGFR、タンパク質キナーゼスーパーファミリーに属する膜タンパク質を研究しました。リガンドが結合すると、受容体が活性化し、その後、別の活性化したEGFRとの二量体を形成し;後続のシグナルカスケードは、細胞増殖9を駆動します 。異常なEGFR発現または活性につながる変異は癌10の多くの種類の中で中心的な役割を果たしています。 StudyinG全細胞におけるこの膜受容体の空間的配置は、その機能と11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。しかし、それは直接biochemical-または従来の顕微鏡法15で（サブ）細胞レベルでのEGFRモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を調べるために困難なまま。我々の方法は、複合体中のタンパク質の位置を決定することができるように、数ナノメートルの空間分解能でのEGFRを可視化することが可能です。最も重要なのは、化学量論的分布に関する得られた情報は、無傷の細胞内タンパク質の天然の状況に関するものです。 ラベルと受容体との間の短い距離を達成するために、EGFRを直接QDにビオチン - ストレプトアビジン結合を用いて、そのリガンドEGFを介して標識しました。このラベルは、蛍光 - および電子顕微鏡の両方を検出することができます。私たちは、COS7細胞の相関イメージングでは、このラベルを使用しています以前1,16,17マイクロ流体チャンバ内に封入された液体。しかし、QDあたりストレプトアビジン分子の複数のアカウントで、このラベルは、低標識効率というより高価な実験につながる、受容体のクラスター化を誘導することができる、それは調査中のタンパク質の化学量論に結論することはできません。ラベル誘導される受容体のクラスタリングは一つだけのストレプトアビジン量子ドット（STR-QD）が結合されたビオチン化EGFを含むプローブで得られ、ここで提示二段階標識化手順を使用することによって完全に回避することができます。細胞は、まず、ビオチン化EGFと共にインキュベートし、次いで固定されています。固定工程は、タンパク質のプロセスは（固定の速度に依存）が停止された時点を決定します。 STR-QDは、標識プロトコルの2番目のステップで、その後に適用されます。タンパク質が固定されるとタンパク質の動的な膜の動きが阻害されるため、クラスタリングは行われません。である。また、STR-QDソリューション、実験の最も高価な成分は、最適化された低濃度で適用することができ、そして標識のこの第二段階は、時間重要ではない、 すなわち、QDは、数分内に結合することができます。 細胞全体に分布するようにEGFRの化学量論を研究するために、細胞試料は、シリコンマイクロチップ18上に作製しました。二段階QD標識、および蛍光顕微鏡画像の記録を適用した後、細胞を、純水でリンスし、そしてESEM-STEM 19を使用して水和状態で撮像されました。結果として得られる相関画像は、水和した細胞の彼らの自然な文脈での細胞のEGFR分布、および化学量論に関する情報を提供します。同様の方法は、最近の研究7乳癌細胞におけるHER2タンパク質を研究するために使用しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AF6000 + DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESEM</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td>Quanta 400 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstripper</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>25-056 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1058.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>O163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shoul</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>E3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium teraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10173MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon microchips with silicon nitride membranes</td>
			<td>DENS Solutions</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>of 50 nm thickness and dimensions of 50 &#181;m x 0.40 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

このプロトコルは、COS7線維芽細胞上の上皮成長因子受容体（EGFR）のラベル付けを説明し、その後の相関蛍光顕微鏡および水和状態における全細胞の環境制御型走査電子顕微鏡（ESEM）。蛍光量子ドット（QD）は、受容体の標識誘発性クラスタリングを回避しながら、効率的かつ特異的なタンパク質標識を提供し、二段階標識化プロトコルを介してEGFRに結合させました。蛍光顕微鏡は、EGFRの細胞位置の概観画像を提供しました。走査型透過電子顕微鏡（STEM）検出器は、ナノスケールの分解能でQDのラベルを検出するために使用しました。結果として得られる相関画像は、水和した無傷の細胞の自然な文脈での単一分子レベルでの細胞のEGFR分布、および化学量論のデータを提供します。 ESEM-STEM像は、モノマーとして、ホモ二量体として、そして小さなクラスターに存在するように受容体を明らかにしました。二つの異なる量子ドットを用いた標識、すなわち、一つは655 nmで発光すると800に類似した特性の結果を明らかにしました。

図1及び2は、無傷の 、完全に水和したCOS-7細胞中で可視化QD655標識し、膜に結合したEGFRの代表的な画像を示します。 図1のAでDIC画像は、細胞の膜地形の印象を与え、 図1Bに対応する蛍光画像は、EGFビオチンのインキュベーションの3分後にEGFRの分布を示している。 図1AおよびBは、それぞれ 2から一緒に縫合されています40Xエア目的で記録された画像。 EGFはEGFRの細胞表面全体にわたって分布している活性化されます。ほとんどの細胞では、蛍光のわずかな増強（ 図1B）は、EGFR 20の局所的に増大した発生したことを示す、セル端部で見られます。同様のプロトコルを用いて行った対照実験（データは示されていない）特定のEGFR標識を検証しました。これらのコントロールが含ま：CEの以前のインキュベーションなし1）対照用標識EGF-ビオチンとLLS、 すなわち、STR-QDを持つ唯一のインキュベーション、および非ビオチン化EGFおよびSTR-量子ドットと2）のインキュベーション。 四角形でマークされた三つのセルは、さらに、ESEM-STEMで調査しました。 図1Cに示されているESEM-STEM像- Eは 、これらの細胞の低倍率の概要を示しています。これらの透過画像は、窒化シリコン（SiN）覗き窓を有するシリコンマイクロチップ上に配置されたセルの上に存在する水の薄い層を有する水和状態で全細胞を反映します。顕微鏡の真空チャンバは、水蒸気を含有し、試料温度と圧力との間のバランスは、細胞上の液体の薄層を維持するように調整しました。個々の細胞は、容易にSiN膜ウィンドウにその形状および位置のために認識することができます。低倍率ESEM-STEM像は、糸状仮足、隣接セルに向かってセル端から延びる、およびいくつかの構造などの微細構造を明らかにする薄いセル領域の内側。サンプルを通る伝送が使用されるエネルギー（30keVの）の電子に対しては不可能であるため、核を含む厚い中央の細胞領域が白く見えます。 高解像度のESEM-STEM像が薄く、周辺領域に記録されました。薄い液体層内の細胞の薄い領域中のナノ粒子のESEM-STEM用の空間分解能は、3ナノメートルに達するために、以前の研究6で決定しました。 図2（a）に示す 4つの高解像度画像- Dは図1Cに小さな長方形の位置で記録した- E.を使用倍率は明るく、弾丸形状のロッドに現れる、個々の量子ドットを識別するのに十分であった、個別にバインドされた各EGFR。 QD655は6×14 nmの2の典型的な寸法を有します。 矩形領域に対応する図2Aは、（Figuのセルに表示されています1C RE）膜上のQDラベルが画像を横切る斜め倍を示しています。この膜構造は、周囲の膜の領域よりも高いEGFR密度を有します。いくつかの場所では、2つのラベルが近接にありました。 20および24ナノメートルの距離の2つの例が矢じりで示されています。ラベルのこれらのペアは、EGFR二量体に属するものとして解釈される。 図2Bは 、EGFRの単量体および二量体も同様に見ることができ、細胞（ 図1D、左の長方形）の端から例を示します。 図2C（図1C、右の矩形）低い蛍光信号、 すなわち、下のEGFR密度の領域から記録しました。それにもかかわらず、EGFRも同様に二量体で、ここで発見されました。また、10または11のEGFRの二つのクラスタが存在していた（楕円を参照）。 図2Dは ​​、いくつかの単量体に加えて、5-6のEGFRなどの小さいクラスターを有する膜倍（ 図1E）の他の例を示していますそして、二量体。 このデータから得られる情報の種類の一例として、対相関関数21 G（x）は、図2中のすべてのラベルの位置について決定した。この分析は、このプロトコルの一部ではないことに注意し、手順を説明しました他の場所で6,7。 G（x）は、基準粒子から一定の半径方向の距離xの中に発見される粒子の可能性の尺度です。 G（x）= 1ランダムな分布を示し、大きい値は、クラスタリングの証拠です。 210ラベルの合計の位置が自動的に図2A-Dの4つの画像で検出された、およびg（x）は5nmのビンサイズ及び10nmの帯域幅を有する平滑化フィルタを用いて計算しました。 G（x）の曲線（ 図3）は、25nmの好ましい中心QDの距離を示しています。 EGFRには、このようにランダムに配向していないが、それらの大部分は、この好ましい距離で存在します。 approximatから電子分子モデル6（ 図3挿入図）私たちは、QDおよびEGF結合ポケットの中心間距離は〜14nmであり、EGFRにダイマーに取り付けられた2つの量子ドット間の中心間の距離に達すると推定しています（この値は、リンカーの柔軟性のために、数ナノメートルだけ変化する可能性がある）〜27nmであること。好適なラベル距離は方法の精度内でのEGFR二量体の予想ラベル距離とこのように一致しています。 G（x）の曲線は、データと一致したクラスタの存在を示す、最大300nmの距離を統一よりも大きいです。この分析は、EGFRの化学量論は、提案手法を用いて研究できることを示しています。 図4は 、標識は、EGF-QD800で行い、63X油浸対物レンズは、蛍光画像のために使用したことを除いて、図2と同様の結果を示しています。このデータは、これらの典型的な結果も発見されたときことを確認しますEGFRの標識は近い赤色スペクトルで発光する量子ドットを用いて行われている。 図4（a）は、代表的な細胞の蛍光画像である、 図4Bは、ESEM-STEMの概要モードと図4Cの同じセルが記録15万倍の倍率の画像であることを示していますセルの上位膜の境界で（ 図4Bの四角形を参照）。 図2AおよびDを図のように 、画像は、膜倍にQDで標識されたEGFRをキャプチャして、モノマー、ダイマー、およびクラスタ化された受容体を示しています。 〜5nmの彼らの小さいコアサイズ22と一致し、電子密度の高い量子ドットのコアは655 nmで発光する量子ドットのコアよりもやや小さく、丸く表示されていることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> 図1.相関DIC、蛍光およびEGF-QD655のESEM-STEMは、完全に水和したCOS-7細胞に、EGFRをラベル </st原形質膜の地形的な印象を与えるのSiN膜のウィンドウ領域上で増殖した細胞の&gt;（A）DIC画像を栄。 （B）（破線の長方形でマーク）中央に位置するのSiN膜ウィンドウ上の細胞を示す蛍光画像。 （C - E）三ESEM-STEM低倍率の画像A、B内の四角形でマークされた細胞から。これらの細胞概観画像が記録され、その後、高解像度画像の正確な位置を決定するのに役立ちます。 （ 図2A-Dに示されている）4つの高解像度画像の位置は、白い長方形のマークが付いています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <stroNG&gt;図2.高解像度ESEM-STEM像は、膜結合のEGFRを描いた。 図1（b）にマークされた領域の75,000Xの倍率で（A）顕微鏡写真。多くのモノマーは、表示されます。いくつかの二量体は矢頭で示しています。 （B）、左の50,000X倍率で取得（C）画像、 図1Cにマークされ、それぞれの権利、膜の領域。 EGFRのクラスタは概説されています。 （D）図1Dにマークされた場所に50,000X倍率で記録した画像は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> 図3対相関関数g（x）の半径方向距離の関数がインターパルティについて決定xと<html>図2A-Dに検出されたすべての210のラベルのCLEの距離は25 nmでのピークは、Ag（x）は1に偶然を示し=なる中心QD距離は、ランダムより発生する非常に高い可能性を有することを示します。破線はラ​​ンダム分布の目表すG（x）のためのガイドです。挿入図は、ビオチンを介して結合した結合されたEGFおよびストレプトアビジンコーティングされた量子ドットとのEGFR二量体のおよその分子モデルを示します。 1stpのCPKモデルから得られたストレプトアビジン、EGFとEGFRのモデル（ストレプトアビジン）、1EGF（EGF）、1NQL、2JWA、1M17、1IVOと2GS6（EGFR）の構造のJmolバージョンで作成されたRCSBプロテインプロテインデータバンク、中12.2.15。 RCSBリガンドExplorerバージョン1.0に描かれたビオチンモデルである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; 図4.代表的なCOS-7細胞は、EGF-QD800で標識し、蛍光相関とESEM-STEMで撮像した。（A）蛍光画像、（B）低倍率の概要ESEM-STEM像。 （C）150,000X倍率でBにおける矩形の位置で記録された高解像度の画像。 、モノマー、ダイマー、およびクラスタのEGFRは、EGF-QD655での標識に似て検出されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K ビュー.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

ビデオ: Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

非対称受容体のパターンでセルローリング軌道を勉強

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

生物工学

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

マイクロインジェクションアッセイをキズや<em&gt;インビボ</em&gt;表皮の局在は、応答記者傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...