パッチクランプ実験で使用するために心房筋細胞を分離することは、細胞レベルと分子レベルの両方で心房電気生理学の知識と理解を大幅に進めています。我々が用いるアプローチは、細胞の心房電気生理学および不整脈の広範なモデルおよび条件の調査に使用することができる多数の孤立した心筋細胞を効果的に生み出す。心房筋細胞を単離するためのトランク消化アプローチを採用しています。
このアプローチの利点は、研究者が調査したい特定の地域を選択できることです。テキスト プロトコルで説明されているように、機器とソリューションの準備からこの手順を開始します。解剖プレート、解剖ツール、パスツールピペット、火磨きピペットをレイアウトします。
このプロトコルは、雄または雌の野生型マウス、遺伝子変異を運ぶマウス、および疾患のマウスモデルに対して実行することができる。テキストプロトコルに記載されているようにマウスの安楽死に続いて、ペーパータオルまたはコルクボードの上にマウスを置き、足をテープでテープで留め、マウスを所定の位置に保持します。70%エタノールでマウスの胸を濡らします。
湾曲したはさみを使用して、胸を覆う毛皮と皮膚を取り除きます。次に、ラット歯の鉗子を使用して胸骨を持ち上げ、肋骨の端に沿って横隔膜を切断します。湾曲したはさみを使用して胸部全体を取り除き、心臓を露出させます。
心房の付属物を取り除くために、細かい解剖鉗子を使って付属物をそっと持ち上げ、春のはさみで切り取ります。すぐに温められた変質タイロードのpH 7.4の解決の20ミリリットルを含んでいるケイ素コーティングされた解剖皿に心房の付属品を移す。解剖ピンを上部に1つ、心房付属器の開口部の下部に1つのピンを置きます。
パスツールピペットを使用して、血液を除去するために加温修飾タイロードのpH 7.4溶液でアテリアを洗い流す。上端と下端に沿って切断して心房の付属物を開きます。次に、心房の付属物の角を固定して、平らな長方形の組織を作成します。
スプリングハサミと細かい鉗子を使用して、心房の付属物を約8〜10の等しいサイズのストリップに切ります。ストリップは、組織の主な部分から切り離されると収縮することに注意してください。小さなボア火磨きピペットを使用して、加温修飾タイロードのpH 6.9溶液を含む最初のチューブに組織ストリップを移します。
5分間待ちます。さて、ミディアムボア火磨ピペットを使用して、修正されたTyrodeのpH 6.9溶液を含む第2ラウンド底部チューブに組織ストリップを移します。ティッシュストリップを洗うために、5ミリリットルの丸い底のチューブをキャップし、チューブを3回そっと反転します。
中穴の火磨かれたピペットを使用して組織ストリップを第3のチューブに移す前に、組織ストリップをチューブの底に落ち着かせてください。反転によってストリップをもう一度洗います。次いで、ミディアムボア火を研磨したピペットを使用して酵素溶液に組織ストリップを移し、30分間インキュベートする。
組織ストリップが一緒に付着するのを防ぐために、3〜5分ごとにチューブを旋回します。酵素消化の開始時に、組織ストリップは渦巻きに続いてすぐに落ち着く。約20分間の消化で、組織ストリップは渦巻き後の酵素溶液中に浮き始める。
この間、心房組織ストリップは、消化されるにつれて淡いピンクから白への外観も変化する。酵素消化後、調製した5ミリリットルの丸底チューブに2.5ミリリットルのKB溶液を使用して3回の溶解を行います。洗浄ごとに、ミディアムボア火磨きピペットを使用して組織を次のチューブに移動する前に、チューブを3回そっと反転します。
最後の洗浄に続いて、2.5ミリリットルのKB溶液を含む14ミリリットルの丸底のチューブにストリップを移します。5分間待ちます。広いボア火磨きピペットを使用して、7.5分間組織を穏やかにトリチュレートします。
これは機械的に組織ストリップを解化し、個々の心筋細胞で満たされた曇った溶液を生み出す。トリアージの最初のトリジテーションは、細胞に損傷を与えることなく多数の細胞を生成するように調整する必要があります。マウスの年齢や病気の状態などの要因を考慮してください。
広いボア火磨きピペットから組織ストリップを排出する頻度と速度の両方を変更することにより、個々の分離にトリチャレーションの力を調整します。穏やかな三国化は低い細胞収量をもたらすが、粗い三国化は多くの死んだ細胞をもたらす。三角組織ストリップを含む14ミリリットルの丸底チューブをKB溶液で満たし、実験用の細胞の所望の密度に応じて7〜10ミリリットルの最終体積にします。
このチューブを室温に1時間置きます。このインキュベーション期間に続いて、細胞は最大7時間の様々な実験に使用することができます。ここに示されているのは、正常マウス由来の単離された心筋細胞の例である。
孤立した心房筋細胞は、通常、長さが100ミクロン、幅が10ミクロン、明確な線条を伴う順である。孤立した心房筋細胞の容量は、典型的には40〜70ピソウラドである。現在のクランプモードで穿穿パッチクランプ技術を用いて記録された心房筋細胞作用電位の一例を示す。
ナトリウム電流の代表ファミリーは、パッチクランプ技術の全細胞構成に記録された。これらの電流は、負の100とマイナス120ミリボルトの保持電位から正の10ミリボルトの間の50ミリ秒の電圧クランプステップを使用して記録された。ここでは、ナトリウム電流電圧関係の概要を示します。
カルシウム電流の代表的なファミリーは、負の70ミリボルトの保持電位から負の60と正の80ミリボルトの間の250ミリ秒の電圧クランプステップを使用して記録された。カルシウム電流電圧関係の概要がここに表示されます。カリウム電流の代表的なファミリーは、負の120ミリボルトと正の80ミリボルトの間の500ミリ秒の電圧クランプステップを使用して、負の80ミリボルトの保持電位から記録されました。
ここでは、総カリウム電流について要約電流電圧関係を示す。心房筋細胞の分離が成功することは、適切な酵素消化とトリアージの間の細胞の機械的解離の両方に依存することを覚えておくことが重要です。心房筋細胞は、いったん単離されると、ナトリウム電流、カルシウム電流、カリウム電流などの作用電位形態およびイオン電流の測定のためのパッチクランプ実験に使用することができます。
心房筋細胞電気生理学の変化を調査することは、心房不整脈を脅かす生命の細胞および分子基盤を決定し、心房不整脈の抗不整脈化合物の開発および試験に不可欠であった。
