この研究は、MRC博士研修パートナーシップ(MR/K501293/1)、英国再生医療プラットフォーム(MRC MR/L022974/1およびMR/K026666/1)、チーフサイエンティストオフィス(TCS/16/37)からの賞でサポートされました。

1. ヒト多能性幹細胞(hPSC)のラミニン-521の維持
<ol><li>ラミニン-521(LN-521)上の6ウェルプレートで37°Cおよび5%CO2でヒト多能性細胞(hPSC)を維持します。分化のために選択した播種日(0日目)までの6ウェルプレートのウェルあたり、幹細胞維持培地(すなわちmTeSR1培地)を毎日2mLで細胞に供給する。</li>
	<li>細胞採取前に、70~80%の望ましい細胞合流を確実に達成してください。</li>
</ol>2. ラミニン-521 マルチウェル製剤と分化のための hPSC シード
注:LN-521(例えば、マトリゲルまたはフィブロネクチン)上で維持されていないhPSCについては、継ぎ手化し、分化を引き出す前に1週間LN-521および培養物にhPSCを分割し、プロセス15、17、18の効率を向上させる。
<ol><li>ラミニンコーティングプレート調製<ol>
<li>組換えLN-521(100 μg/mL)のバイアルを4°Cで2時間または一晩解凍します。</li>
		<li>解凍したLN-521をCa2+/Mg 2+で氷冷1x DPBSで希釈して8μg/mL溶液を調製します。</li>
		<li>96ウェルプレートの各ウェルに、8 μg/mL LN-521溶液の0.25 mLを24ウェルプレートまたは0.05 mLの各ウェルに追加します。プレートを左右に軽く揺らし、LN-521溶液でウェルを均等にコーティングします。 注:96ウェルプレートフォーマットでは、ボリュームディスペンス、セルシード、および中程度の変更は、半自動化されたパイプラインを使用して行うことができます。詳細については、メセゲール・リポレスら19を参照してください。</li>
		<li>LN-521被覆プレートを半透明で柔軟なフィルムで密封し、使用前に一晩4°Cで保管してください。 注:LN-521コーティングされた版は4°Cで貯えられるとき2週間まで使用することができる。 ラミニンコーティングされた井戸の乾燥は避けてください。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞の播種の日に、細胞培養インキュベーターで、30~60分間、細胞培養インキュベーターでプレートを温め、30~60分間温める。</li>
	<li>LN-521溶液を吸引する。 注:LN-521コーティングの損傷を防ぐために、ウェルの底部に吸引器を直接接触しないようにしてください。</li>
	<li>24ウェルプレートまたは0.05 mLの各ウェルに24ウェルプレートまたは0.05 mLの各ウェルに、新鮮な補充された10 μM Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y27632を付けた幹細胞維持培地0.5 mLを96ウェルプレートの各ウェルに分配します。プレートをインキュベーターに入れ、細胞の播種の準備が整うまで置きます。</li>
	<li>スケジュールされたシード日(0日目)とhPSC合流率が70~80%の間で、6ウェルプレートの底部に自発的分化の領域をマークします。 注:自然分化は、位相差顕微鏡を用いた細胞サイズの大きな変化や異なる細胞形態の存在によって可視化することができます。</li>
	<li>吸引し、分化のマークされた領域と井戸から使用済み培地を廃棄します。室温(RT)でCa2 +/Mg2+なしでDPBSの1 mLで各井戸を洗浄します。 </li>
	<li>各ウェルに酵素を含まない解離試薬1 mL ( 材料表を参照)を加え、細胞が目に見えてプレートから外れるまで、37 °Cで 8~10分間インキュベートします。</li>
	<li>セルスクレーパーを使用して、ウェルから細胞をそっと取り外します。ピペットは、P1000ピペットを使用して2~4倍の上下に各ウェルの内容物をピペットし、単一細胞懸濁液を生み出します。各細胞株について、すべての維持井戸から無菌50 mLチューブに細胞をプールする。</li>
	<li>各々を1mLの幹細胞維持培地で洗浄します。適切な細胞株からプールされた細胞を含む対応するチューブに、そのスケを加えます。</li>
	<li>各セルラインについて、プールされたサンプルに対して 3 つの実行可能セルカウントを実行します。各セルラインの平均ライブセル数(ライブセル/mL)を計算します。</li>
	<li>250 x g のプールサンプルを RT で 5 分間遠心分離し、その後、RT 幹細胞維持培地の 1 ~ 3 mL で細胞ペレットを再中断し、10 μM ROCK 阻害剤 Y27632 を補充します。</li>
	<li>各セルラインについて、ステップ2.4で用意したウェルの数に応じて必要なセル数を計算します( 表1を参照)。10 μM ROCK阻害剤 Y27632を補充したばかりの幹細胞維持培地で必要な細胞数を再中断します。</li>
	<li>以前に追加したボリュームを取り除かずに、ステップ2.4から準備済みプレートとプレコーティングプレートのウェルに計算されたボリュームを追加します。ウェルあたりの総容積は、24ウェルプレートの場合は1mL、96ウェルプレートの場合は0.1mLになります。プレートを左右にそっと揺らし、ウェル全体にセル分散を確実にします。 注:ウェルを横切る偶数セル分布は、均質な細胞の播種と分化を確実に行う鍵となります。</li>
	<li>播種したプレートをインキュベーターに入れ、シードプレートを優しく前後に左右に揺らし、細胞を均等に分配し、培養物を37°Cおよび5%CO2に維持します。</li>
</ol>3. ラミニン-521上の肝前駆物質にhPSCを分化
<ol><li>正しい添加剤を添加したEndoderm Basal培地を使用して、決定的な内胚葉誘導(ステージ1)の培地を準備します。<ol>
<li>0日目に、エンドデドルム基底培地のボトルを一晩4°Cで解凍します。</li>
		<li>必要に応じて、ステージ 1 のミディアム 1 (1 日目に使用) を準備します。</li>
		<li>氷の上のサプリメントMRとサプリメントCJを解凍します。</li>
		<li>希薄サプリメントMRとサプリメント CJ 1:100 内皮基底培地.</li>
		<li>必要に応じて、2~4日に使用するためにステージ1中2を準備します。</li>
		<li>薄いサプリメント CJ 1:100 内皮基底培地.</li>
	</ol>
</li>
	<li>肝前駆物質培地を用いて、その後の肝前駆細胞仕様(ステージ2)分化のための培地を準備する。<ol>
<li>4日目、肝前駆媒のボトルを一晩4°Cで解凍する。 注:1%ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度は100 IU/mL、100 μg/mL)を用いた。抗生物質は必要ありません。抗生物質の使用は、ユーザーの裁量で行われます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分化の1日目に、10 μM ROCKi Y-27632培地を使用した使用済み幹細胞維持培地をウェルから取り出し、24ウェルプレートのウェルあたり0.5mLの完全なステージ1ミディアム1と96ウェルプレートのウェルあたり0.1 mLに置き換えます。</li>
	<li>2日目、3日目、4日目に、使用済み培地を取り除き、96ウェルプレートのウェルあたり24ウェルプレートまたは0.1 mLの場合は、ステージ1ミディアム2の0.5mLをそれぞれ十分に供給します。</li>
	<li>5日目に、免疫細胞化学を介して決定的な内胚分化分析のためにウェルを固定する。残りの井戸については、使用済み培地を取り除き、24ウェルプレートまたは96ウェルプレートのウェルあたり0.1 mLのウェルあたり0.5mLの肝前駆子分化培地で各井戸を供給します。6 日、7 日、9 日目にメディアを再び更新します。</li>
	<li>10日目には、肝前駆細胞分化分析のためのウェルを収穫するか、または更なる肝細胞様細胞分化を進める。 注:この時点で、サンプルを免疫細胞化学分析のために4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定したか、ELISAのために上清を採取し、タンパク質定量のために細胞を採取した。</li>
</ol>4. ラミニン-521上のhPSCから生成される肝前駆物質分化培養の特徴
<ol><li>5日目に、免疫染色を用いて決定的な内胚性マーカーの発現を検出する。</li>
	<li>10日目に、免疫染色を用いて肝前駆物質特異的マーカーの発現を検出する。</li>
	<li>10日目に、メーカーの指示に従ったキットを使用してELISA経由でAFPおよびALB分泌を測定し、バイチンチオン酸(BCA)タンパク質アッセイによって決定されるmgタンパク質当たりの正規化を行います。</li>
	<li>1ウェル当たりHNF4α陽性細胞の割合を定量化することにより、96ウェルプレートの肝前駆細胞変動を評価する。</li>
</ol>5. 免疫細胞化学と画像取得
<ol><li>分化の5日目と10日目に、細胞3xを1x DPBSで洗浄し、24ウェルプレートのウェルあたり0.5 mL、96ウェルプレートのウェルあたり0.1 mLで洗浄します。RTで2〜5分間穏やかな揺れでプレートをインキュベートします。 注:免疫細胞化学のためにCa2 +/Mg2+なしでDPSBを使用してください。</li>
	<li>24ウェルプレートに対してウェルあたり0.3 mL、96ウェルプレートのウェルあたり0.1 mLを加えて、RTで4%パラホルムアルデヒド(PFA)を15〜30分間固定します。</li>
	<li>ステップ5.1で説明したように1x DPBSで3倍を洗浄します。</li>
	<li>0.1%のトゥイーン、1x DPBSを使用してPBSTで膜を透過させ、96ウェルプレートのウェルあたり0.3 mLのPBSTを1ウェルあたり0.3 mL、96ウェルプレートあたり0.1 mLを加えることで、RTで20分間インキュベートします。</li>
	<li>1時間PBSTで10%BSAで細胞をインキュベートし、96ウェルプレートのウェルあたり24ウェルプレートと0.1mLのBSAのウェルあたり0.3mLのBSAを加え、プレートシェーカーを使用して穏やかに振盪することによってタンパク質ブロックを実行します。</li>
	<li>タンパク質遮断後、ブロッキング溶液をPBSTで1%BSAで希釈した一次抗体に置き換え、一晩穏やかな揺れで4°Cでインキュベートします。 注:タンパク質ブロックと抗体の添加の間で洗浄しないでください。</li>
	<li>24時間後、PBSTで3倍の井戸を洗浄します。</li>
	<li>2次抗体をPBSTに1%BSAに添加します。穏やかな揺れで暗闇の中でRTで1時間インキュベート。</li>
	<li>二次抗体インキュベーション後、1x DPBSでウェル3xを洗浄し、穏やかな揺れで暗闇の中でRTで10分間のメーカーの指示に従ってHoechst染色剤を分配します。</li>
	<li>1x DPBSで3倍洗います。プレートはイメージングの準備が整いました。 メモ:イメージが作成されるまで暗闇の中で4°Cでプレートを保管してください。</li>
	<li>免疫検査後の高含有イメージング顕微鏡を用いてマルチウェルプレートを画像化する。ウェルの真の表現を得るためには、いくつかの視野の画像取得が推奨される。異なるマーカーの発現は、市販ソフトウェアを用いた細胞セグメンテーション解析(表図)を用いて評価した( 図1)。 注: CellProfiler やフィジー20,21などの画像解析オープンソースソフトウェアを使用してセルセグメンテーションを実行することもできます。</li>
</ol>

<ol>
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デビッド・C・ヘイは、ステムノベート株式会社の共同創設者兼株主です。残りの著者は、この記事で議論されている主題または資料に利益相反がないことを証明しています。

大規模に多能性幹細胞からヒト肝前駆細胞を生成することは、死体由来の物質に代わる有望な代替手段を表す可能性がある。プロトコルの標準化と再現性は、バイオメディカル研究における技術翻訳とインパクトを確保するための鍵です。これに対処するために、以前の研究では、定義された添加剤と行列15、23、24、25、26、27、28を使用して、hESCおよびiPSCからの段階的な差別化プロトコルの開発に焦点を当てていました。これを行うことにより、肝細胞表現型と再現性が向上し、分化プロセス19の半自動化が可能となった。提供されるシステムは、既製の細胞培養培地および容易な肝細胞分化システムとの組み合わせによって強化される。
以前は、分化プロトコルの開始前に多能性細胞密度が肝前駆細胞26の均質集団を達成するための重要な変数として強調された。このより洗練された手順を用いて、開始細胞密度の範囲を用いて段階的に多数の幹細胞由来肝前駆細胞を生成することができる(表1)。5日目に、Sox17染色法により決定的な内胚誘発が検証された(図3)。試験したESCとiPSCの両方のラインで、80%以上がSox17を発現することで、決定的な内胚葉への効率的かつ堅牢な分化が達成されました(図3)。10日目には、肝前駆物質は均一な石畳様の形態を示し、肝幹細胞マーカーはAFPとHNF4αの両方に対して高度に濃縮された(>86%、 図4)。手動技術と半自動技術を組み合わせて使用して、複数のプレートフォーマット19で分化を行うことが可能でした。
その現在の形態では、細胞分化は 、インビトロ ベースの実験に適している。しかし、肝前駆物質の均質な集団が送達のために準備されるようにするために、臨床応用の前に細胞濃縮が必要になる可能性が高い。
結論として、ここで説明するプロトコルは、大規模に肝前駆物質を生成するための標準化されたアプローチを分野に提供する。今後の作業は、HLCの分化、成熟、およびメンテナンスのための新しい媒体の生産に焦点を当てます。

肝臓病は世界的な健康問題であり、世界で年間約200万人の死亡を引き起こしている。肝疾患を研究し、臨床的に介入するモデルシステムの数が存在するが、細胞系システムの日常的な使用は重大な欠点によって制限される(レビューのためにSzkolnickaらら2参照)。高度なヒト多能性幹細胞(hPSC)培養および体細胞分化法は、クリニック3,4の分化細胞の基礎生物医学研究および再生可能な分化源のためのツールを開発する有望な技術を表す。
現在までに、肝細胞様細胞(HLC)分化のための複数のプロトコルが5、6、7、8に開発されてきた。これらのプロトコルは、低分子と成長因子9,10を組み合わせて、ヒト肝臓の発達の側面を再現しようとします。ほとんどのプロトコルは段階的な分化プロセスで構成され、hPSCは決定的なエンドドームにプライミングされ、続いて肝前駆子仕様11、12、13がHLC仕様で終わる。これらのプロトコルによって生成されたHlcは、胎児と成人のフェノタイプの混合物を表示する。これには、HNF4αおよびアルブミン(ALB)などの肝細胞マーカー、ならびに薬物代謝容量14、15、16などのαフェトプロテイン(AFP)の発現が含まれる。研究所間で, HLC 分化は異なる場合があります。したがって、標準化されたプロトコルの開発が必要です。これにより、研究者は、幹細胞由来のHLCを大規模に生成し、基礎的および臨床的研究に効果的に適用することができます。
ヒト胚性幹細胞と誘導多能性幹細胞株の両方に適用できる肝前駆細胞分化システムが開発されました。この手順は、細胞培養フラスコから96ウェルプレートに至るまで、様々な培養器形式で肝前駆細胞の均質集団を生み出す。以下に提供されるプロトコルは、幹細胞由来の肝前駆物質を24および96のウェルフォーマットで生成する。
以下に示すプロトコルで使用されるセル密度は、それぞれ24および96ウェルプレートの1つのウェルに対して指定される( 表1を参照)。異なる細胞培養板フォーマットおよび細胞株に対しては、開始細胞数の最適化が必要である。プロトコル最適化の開始セル密度は、2 x 105 セル/cm2です。密度最適化のために、一度に50,000個のセル/cm2± を追加することで、複数のセル密度をテストできます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:719px;" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14040133</td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342 Ready Flow Reagent</td>
			<td style="width:171px;">thermofisher</td>
			<td>R37165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Endoderm Basal Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Hepatic Progenitor Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Antibodies</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td style="width:107px;">1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td style="width:107px;">1:400 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HNF-4&#945;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">IgG</td>
			<td style="width:171px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sox17</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1:200 (Goat)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">Columbus Image Data Storage and Analysis system</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hepatic progenitor specification from pluripotent stem cells using a defined differentiation system

肝疾患は世界的な健康問題のエスカレートです。肝臓移植は効果的な治療法ですが、ドナー臓器の入手不足により患者の死亡率が増加しています。臓器不足は、基礎研究やクリニックのためのヒト肝細胞の日常的な供給にも影響を及ぼす。したがって、ヒト肝前駆細胞の再生可能な供給源の開発が望ましく、本研究の目標である。ヒト肝前駆物質を大規模に効果的に生成・展開できるように、再現性肝前駆物質分化システムを開発した。このプロトコルは、さまざまな細胞培養器形式のユーザー間の実験的再現を支援し、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞株の両方を使用して分化を可能にする。これらは、基礎研究を強化し、臨床製品開発への道を開く可能性があり、現在の分化システムよりも重要な利点です。

hESC(H9)とhiPSC(P106)の両方のラインからの肝前駆体分化は、図2に記載されたステップワイズプロトコルに従って行った。ここで、多能性幹細胞は、分化開始前に単一細胞としてLN-521コーティングプレートに播種した。細胞の合流性は、堅牢で再現性の高い分化の鍵となります。適切な合流性が達成されると(図2)、分化が開始された。5日目に、決定的なエンドオダーム仕様をSox17式で評価した。両方の細胞株において、Sox17はH9およびP1 ±06に対してそれぞれ0.5%および87.8%±0.5%のSEMで80%、87.8%で高発現した(図3)。10日目に、肝前駆物質は石畳のような形態を示した(図2)。また、肝前駆体の仕様は、HNF4α、AFP、ALB、およびサイトケラチン-19(CK19)発現、ならびにAFPおよびALBタンパク質分泌10、15、22(図4)について評価した。H9およびP106肝前駆物質培養物はいずれも、HNF4α(91%±0.5%、90%±0.2%)、AFP(89.7%±1.8%、1.2%±86%)、CK19(78.5%±3.2%、83.6±%)を示した。AFP の分泌は、10 日目に両方の細胞株で検出されました (32.4 ± 1.6 および 47.8 ± 5.9 ng/mL/mg/24 h) (図 5)。アルブミン合成は、より低いレベル(30.7%±1.8%および27.2%±1.1%)で観察され、ELISA(図5)を介して検出されなかった。
このプロトコルは、24ウェルから96ウェルプレートまでの肝前駆物質の標準化された生産を可能にした。半自動化されたパイプラインは、前述の17のようにH9およびP106細胞株から96の肝前駆細胞の井戸プレートを製造するために採用された。HNF4α発現の定量化を通じて細胞数変動性及び肝前駆腫分化効率を評価した。高含有イメージング装置を用いた免疫蛍光によるタンパク質定量に対して細胞セグメンテーションを行った(図1)。10日目の肝前駆細胞は、P106のH9および97%HNF4α陽性細胞に対して1ウェル当たり>94%のHNF4α陽性細胞を有する行間で有意な変動性を示さなかった(図6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2.jpg"> 図1:細胞セグメンテーションパイプラインの概要(A)元の画像を用いて、核のセグメンテーションに用いた核染色法を用いた。(C)形状と大きさに基づく核セグメンテーション品質管理ステップを、明確にセグメント化された核のみを定量化するために実施した。(D)これに続いて、正のHNF4α染色された核を定量した。(E)最後に、HNF4α発現細胞を同定するために強度ベースの閾値を採用した。CおよびEにおいて、緑色核は選択された細胞を表し、マゼンタ核は廃棄された細胞を示す。スケールバー= 50 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2.jpg"> 図2:肝前駆子のhPSCからの分 化(A)肝前駆物質分化プロトコルの概略的表現(B) 分化中の形態学的変化を強調する代表的な画像。0日目(D0)では、hPSCは細胞のパックされた単層を提示した。これに続いて、hPSCは5日目(D5)に決定的な内胚葉にプライミングされました。その後、10日目に肝前駆物質分化(D10)が続いた。肝前駆物質は石畳のような細胞形態を示した。 スケールバー= 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2.jpg"> 図3:決定的なエンドオダーム仕様の特性5日目に、細胞をSox17、決定的な内胚葉マーカーについて染色した。Sox17陽性細胞の割合は、H9では80±0.5%、P106では87.8±0.5%であった。パーセント定量は、井戸あたり6つの視野を持つ10の別々のウェルに基づいていました。データはSEMの平均±スケールバー= 50 μmとして表示<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2large.jpg" target="_blank">されます。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3.jpg"> 図4: 肝前駆子の特徴付け10日目に、肝前駆物質(A)HNF4α、(B)AFP、および(C)ALBについて肝前駆物質を染色した。H9の場合、陽性細胞の割合は、HNF4α、AFP、ALBの±91%±0.4%、89.7%±1.8%、30.7%±1.8%であった。P106の場合、陽性細胞の割合は、HNF4α、AFP、ALBに対してそれぞれ90%±0.2%、+/- 1.2%、27.2%±1.1%であった。(D) 胆管球系統電位はCK19発現を介して評価された。H9由来肝前駆物質は、CK19陽性細胞±78.5%±、CK19陽性細胞の83.6%±1.8%がP106肝前駆細胞に対して観察された。免疫グロブリンG(IgG)染色は染色制御として用いた。パーセント定量は、井戸あたり6つの視野を持つ10の別々のウェルに基づいていました。データはSEMの平均±スケールバー= 50 μmとして表示<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3large.jpg" target="_blank">されます。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig5.jpg"> 図5:肝前駆物質タンパク質分泌解析 アルファフェトプロテイン(AFP)とアルブミン(ALB)の分泌は、H9およびP109の10日目に肝前駆体培養物で分析された。データは3つの生物学的複製を表し、誤差バーはSDを表す。ND = 検出されませんでした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2.jpg"> 図6: 96ウェルプレートにおけるウェルウェル変動の評価(A)HNF4αで染色したH9由来肝前駆物質の96ウェルプレート図の可視化。(B)HNF4α陽性細胞の定量化。適切に定量化された 6 つの視野からの、行のウェルあたりのセル数の平均。プレート全体の平均細胞数は、1ウェル当たり0.22SEM HNF4α陽性細胞±94.81%であった。ウェル間に統計的に有意な差は認められない。(C)HNF4αで染色したP106由来肝前駆物質の96ウェルプレート図の可視化(D)HNF4α陽性細胞の定量化。行のウェルあたりの平均セル数は、ウェルあたり6つの視野から、定量化された。プレート全体の平均細胞数は、ウェル当たり0.57SEM HNF4α陽性細胞±97.7%であった。行間に統計的に有意な差は認められない。ウェルH12は免疫グロブリンG(IgG)染色制御として使用した。スケールバー= 1 mmTukeyのポストホック統計テストを用いた一方のANOVAが採用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>プレート形式</td>
			<td>表面積 (cm2)</td>
			<td>cm2 あたりのセル数</td>
			<td>ウェルあたりの合計セル数</td>
			<td>分配量(mL)</td>
			<td>細胞濃度(細胞/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24ウェルプレート</td>
			<td>1.9</td>
			<td>210526</td>
			<td>400000</td>
			<td>0.5</td>
			<td>800000</td>
		</tr>
<tr>
<td>96ウェルプレート</td>
			<td>0.32</td>
			<td>187500</td>
			<td>60000</td>
			<td>0.05</td>
			<td>1200000</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:このプロトコルで使用されるhPSCセルラインの異なるプレートフォーマットに推奨されるセル密度。

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Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

hepatic-progenitor-specification-from-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

4.6K ビュー.  University of Edinburgh. 本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。

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Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

生物学

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

3次元共培養システムNICO-1を用いた卵巣癌幹細胞様細胞の血管遺伝学的特性の評価

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

hiPSC駆動MSCにおける表面抗原と増殖能の特性評価

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

著者スポットライト:iPS細胞と遺伝性疾患研究の進歩 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...