Bu çalışma MRC Doktora Eğitim Ortaklığı (MR/K501293/1), İngiltere Rejeneratif Tıp Platformu (MRC MR/L022974/1 ve MR/K026666/1), Baş Bilim İnsanı Ofisi (TCS/16/37) ödülleri ile desteklendi.

1. Laminin-521'de insan pluripotent kök hücre (hPSC) bakımı
<ol><li>laminin-521 (LN-521) üzerinde 6 kuyu plakasında insan pluripotent hücrelerini (hPSC) 37 °C ve %5 CO 2'de tutun. Hücreleri günlük olarak, farklılaşma için seçilen tohumlama gününe kadar 6 kuyu plakası başına 2 mL kök hücre bakım ortamı (yani mTeSR1 ortamı) ile besleyin (gün 0).</li>
	<li>Hücre hasadından önce istenen %70-80 hücre konflüensinin sağlandığından emin olun.</li>
</ol>2. Laminin-521 çokwell hazırlama ve farklılaşma için hPSC tohumlama
NOT: LN-521'de (örneğin matrigel veya fibronektin) korunmayan hPSC'ler için, hPSC'leri LN-521'e bölün ve sürecin verimliliğini artırmak için farklılaşmayı geçirmeden ve ortaya çıkarmadan önce 1 hafta boyunca kültür15,17,18.
<ol><li>Laminin kaplı plaka hazırlama<ol>
<li>Bir şişe rekombinant LN-521'i (100 μg/mL) 4 °C'de 2 saat veya gece boyunca çözün.</li>
		<li>Buz gibi 1x DPBS'de çözülen LN-521'i Ca 2+/Mg2+ile seyrelterek 8 μg/mL çözelti hazırlayın.</li>
		<li>8 μg/mL LN-521 çözeltisinin 0,25 mL'lik kısmını 24 kuyu plakasının her kuyusuna veya 96 kuyu plakasının her kuyusuna 0,05 mL ekleyin. LN-521 çözümü ile kuyuları eşit şekilde kaplamak için plakayı bir yandan diğer yana hafifçe sallayın. NOT: 96 kuyu plakası formatı için, yarı otomatik bir işlem hattı kullanılarak hacim dağıtımı, hücre tohumlama ve orta değişiklikler yapılabilir. Ayrıntılar için Bkz. Meseguer-Ripolles vd.19.</li>
		<li>LN-521 kaplamalı plakaları yarı saydam, esnek bir filmle kapatın ve kullanmadan önce gece boyunca 4 °C'de saklayın. NOT: LN-521 kaplamalı plakalar 4 °C'de saklandığında 2 haftaya kadar kullanılabilir. Laminin kaplı kuyuların kurumasından kaçının.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre tohumlama gününde, önceden kaplanmış plakaları 37 °C'de bir hücre kültürü inkübatörinde 30-60 dakika ısıtın.</li>
	<li>LN-521 çözümünü aspire edin. NOT: LN-521 kaplamasının zarar görmesini önlemek için aspiratöre kuyunun altı ile doğrudan temastan kaçının.</li>
	<li>24 kuyu plakasının her kuyusuna 0,5 mL kök hücre bakım ortamı ve taze takviyeli 10 μM Rho ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y27632 veya 96 kuyu plakasının her kuyusuna 0,05 mL dağıtın. Plakayı hücre tohumlama için hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Planlanan tohumlama gününde (0 gün) ve % 70-80 arasında bir hPSC konflüansı ile, 6 kuyu plakasının kuyularının dibindeki spontan farklılaşma bölgelerini işaretleyin. NOT: Spontan farklılaşma, faz kontrastı mikroskopisi kullanılarak hücre boyutunda ve/veya farklı hücre morfolojilerinin varlığında büyük bir değişiklikle görselleştirilebilir.</li>
	<li>İşaretli farklılaşma bölgelerini ve harcanan ortamı kuyulardan aspire edin ve atın. Her birini oda sıcaklığında (RT) Ca 2+ /Mg2+olmadan1 mL DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyuya 1 mL enzimsiz ayrışma reaktifi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu)ve hücreler plakadan gözle görülür şekilde kopana kadar 8-10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri kuyulardan nazikçe ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Pipet her kuyunun içeriğini tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için bir P1000 pipet ile 2-4x yukarı ve aşağı. Her hücre hattı için, tüm bakım kuyularından havuz hücreleri steril 50 mL tüp haline.</li>
	<li>Boşaltılan her bir kuyuyu 1 mL kök hücre bakım ortamı ile yıkayın. Yıkamaları, uygun hücre hattından havuza alınan hücreleri içeren ilgili tüpe ekleyin.</li>
	<li>Her hücre satırı için, havuza alınan örnekler üzerinde üç uygun hücre sayısı gerçekleştirin. Her hücre satırı için ortalama canlı hücre sayısını (canlı hücreler/mL) hesaplayın.</li>
	<li>Havuza alınan numuneleri RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Her hücre satırı için, adım 2.4'te hazırlanan kuyu sayısı başına gereken hücre numarasını hesaplayın (bkz. Tablo 1). Gerekli hücre numarasını 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 ile taze takviye edilen kök hücre bakım ortamı ile yeniden başlatın.</li>
	<li>Daha önce eklenen hacmi çıkarmadan, 2.4. Kuyu başına toplam hacim 24 kuyu plakası için 1 mL ve 96 kuyu plakası için 0,1 mL olacaktır. Kuyu boyunca eşit hücre dağılımını sağlamak için plakaları bir yandan diğer yana ve ileri geri hafifçe sallayın. NOT: Kuyu boyunca eşit hücre dağılımı, homojen hücre tohumlama ve başarılı farklılaşma sağlamak için anahtardır.</li>
	<li>Tohumlu plakaları inkübatöre yerleştirin ve hücreleri eşit bir şekilde dağıtmak ve kültürleri 37 ° C ve% 5 CO2'dekorumak için tohumlu plakaları hemen ileri geri ve bir yandan diğer yana hafifçe sallayın.</li>
</ol>3. HPSC'leri laminin-521'deki hepatik progenitörlere ayırt etmek
<ol><li>Doğru katkı maddeleri ile desteklenmiş Endoderm Bazal Medium kullanarak medyayı kesin endoderm indüksiyonu (aşama 1) için hazırlayın.<ol>
<li>0. günde, Endoderm Bazal Medium şişesini 4 °C'de bir gecede çözün.</li>
		<li>Aşama 1 Orta 1'i (1. günde kullanım için) gerektiği gibi hazırlayın.</li>
		<li>Buz üzerinde EK MR ve Ek CJ çözün.</li>
		<li>Endoderm Bazal Medium'da Ek MR ve Ek CJ 1:100'u seyreltin.</li>
		<li>Aşama 1 Orta 2'i gerektiğinde 2-4 gün boyunca kullanıma hazırlayın.</li>
		<li>Endoderm Bazal Medium'da Ek CJ 1:100'u seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hepatik Progenitör Ortamı kullanarak sonraki hepatik progenitör hücre spesifikasyonu (Aşama 2) farklılaşması için ortam hazırlayın.<ol>
<li>4. günde, Hepatik Progenitor Medium şişesini 4 °C'de bir gecede çözün. NOT: Bu deney için %1 penisilin/streptomisinin (sırasıyla 100 IU/mL ve 100 μg/mL'lik son konsantrasyonlar) kullanıldığına dikkat çekildi. Antibiyotik gerekli değildir; antibiyotik kullanımı kullanıcının takdirine bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Farklılaşmanın 1. gününde, harcanan kök hücre bakım ortamını kuyulardan 10 μM ROCKi Y-27632 ortamı ile çıkarın ve 24 kuyu plakasının kuyusu başına 0,5 mL komple Sahne 1 Orta 1 ve 96 kuyu plakasının kuyusu başına 0,1 mL ile değiştirin.</li>
	<li>2, 3 ve 4.</li>
	<li>5. günde, immünosetokmya yoluyla kesin endoderm farklılaşma analizi için kuyuları sabitle. Kalan kuyular için, harcanan ortamı çıkarın ve her kuyuyu kuyu başına 0,5 mL Hepatik Progenitör Farklılaşma Ortamı ile 24 kuyu plakası veya 96 kuyu plakasının kuyusu başına 0,1 mL ile besleyin. Ortamı 6, 7 ve 9.</li>
	<li>10. günde, hepatik progenitör farklılaşma analizi için kuyuları hasat edin veya daha fazla hepatosit benzeri hücre farklılaşması ile devam edin. NOT: Bu dönemde örnekler immünosimya analizi için %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitlenmiş veya ELISA için süpernatant toplanmış ve protein nicelemesi için hücreler toplanmıştır.</li>
</ol>4. Laminin-521'de hPSC'lerden oluşturulan hepatik progenitör farklılaşma kültürlerinin karakterizasyonu
<ol><li>5. günde, immünostaining kullanarak kesin endoderm spesifik belirteçlerin ekspresyonunun saptanır.</li>
	<li>10. günde, immünostaining kullanarak hepatik progenitöre özgü belirteçlerin ekspresyonunun tespitini edin.</li>
	<li>10. günde, üreticinin talimatlarını takip eden bir kit kullanarak ELISA aracılığıyla AFP ve ALB salgılarını ölçün ve bicinchoninic acid (BCA) protein tahlili ile belirlenen mg protein başına normalleştirin.</li>
	<li>Kuyu başına HNF4α pozitif hücre yüzdesini ölçerek 96 kuyu plakasının hepatik progenitör değişkenliğini değerlendirin.</li>
</ol>5. İmmünostokimya ve görüntü edinimi
<ol><li>Farklılaşmanın 5 ve 10. günlerinde, hücreleri 1x DPBS ile 3x, 24 kuyu plakasının kuyusu başına 0,5 mL ve 96 kuyu plakasının kuyusu başına 0,1 mL ile yıkayın. RT'de 2-5 dakika hafif sallanarak plakayı kuluçkaya yatırın. NOT: İmmünostokimya için CA2+/Mg2+ olmadan DPSB kullanın.</li>
	<li>24 kuyu plakası için kuyu başına 0,3 mL PFA ve 96 kuyu plakasının kuyusu başına 0,1 mL ekleyerek RT'de %4 paraformaldehit (PFA) içeren hücreleri 15-30 dakika sabitleyin.</li>
	<li>5.1 adımında açıklandığı gibi 3x'i 1x DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Membranı PBST ile %0,1 Ara, 1x DPBS kullanarak permeabilize edin ve 24 kuyu plakasının kuyusu başına 0,3 mL PBST ve 96 kuyu plakasının kuyusu başına 0,1 mL ekleyerek RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBST'de %10 BSA'ya sahip hücreleri 1 saat boyunca inkübe ederek, 24 kuyu plakasının kuyusu başına 0,3 mL BSA ve 96 kuyu plakasının kuyusu başına 0,1 mL BSA ekleyerek, bir plaka çalkalayıcı kullanarak hafifçe sallayarak protein bloğunu gerçekleştirin.</li>
	<li>Protein blokajdan sonra, blokaj çözeltisini PBST'de% 1 BSA'da seyreltilmiş birincil antikorla değiştirin ve bir gecede hafifçe sallanarak 4 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Protein bloğu ve antikor ilavesi arasında yıkama yapmayın.</li>
	<li>24 saat sonra PBST ile 3x kuyuları yıkayın.</li>
	<li>PBST'de ikincil antikorun %1 BSA'sına ekleyin. Hafifçe sallanarak karanlıkta RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>İkincil antikor inkübasyonundan sonra, kuyuları 1x DPBS ile 3x yıkayın ve hoechst lekesini üreticinin talimatlarına göre rt'de 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak dağıtın.</li>
	<li>1x DPBS ile 3x yıkayın. Plakalar görüntülemeye hazır. NOT: Plakaları görüntülemeye kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>İmmünohistokimitriden sonra yüksek içerikli bir görüntüleme mikroskobu kullanarak multiwell plakasını görüntüleyin. Kuyunun gerçek bir temsilini elde etmek için çeşitli görüş alanlarının görüntü alımı önerilir. Farklı belirteçlerin ifadesi, ticari yazılım kullanılarak hücre segmentasyon analizi ile değerlendirilmiş (bkz. Malzeme Tablosu)(Şekil 1). NOT: Hücre segmentasyonu, CellProfiler veya Fiji20,21gibi bir görüntü analizi açık kaynaklı yazılım kullanılarak da gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Szkolnicka, D., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Advances+in+Generating+Hepatocytes+from+Pluripotent+Stem+Cells+for+Translational+Medicine.">Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine.</a> Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).</li><li>Heslop, J. A., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+for+Modeling+Liver+Development+and+Disease.">The Use of Human Pluripotent Stem Cells for Modeling Liver Development and Disease.</a> Hepatology. 69 (3), 1306-1316 (2019).</li><li>Alwahsh, S. M., Rashidi, H., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cell+therapy:+is+this+the+end+of+the+beginning.">Liver cell therapy: is this the end of the beginning.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 75 (8), 1307-1324 (2018).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayton Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -. P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8 (2), 430-437 (2013).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Khetani, S. R., Blanco, J. G., Iredale, M., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Human+Tissue:+Platforms+to+Evaluate+Drug+Metabolism+and+Safety.">Pluripotent Stem Cell-Derived Human Tissue: Platforms to Evaluate Drug Metabolism and Safety.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 20 (2017).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Developmental Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Shin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+and+Fgf+signaling+are+essential+for+liver+specification+in+zebrafish.">Bmp and Fgf signaling are essential for liver specification in zebrafish.</a> Development Cambridge England. 134 (11), 2041-2050 (2007).</li><li>DeLaForest, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNF4A+is+essential+for+specification+of+hepatic+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Development Cambridge England. 138 (19), 4143-4153 (2011).</li><li>Baxter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+analyses+show+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+better+mimic+fetal+rather+than+adult+hepatocytes.">Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 62 (3), 581-589 (2015).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Domogatskaya, A., Rodin, S., Boutaud, A., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+but+Not+-332,+-111,+or+-411+Enables+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Self-Renewal+In+Vitro.">Laminin-511 but Not -332, -111, or -411 Enables Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal In Vitro.</a> Stem Cells. 26 (11), 2800-2809 (2008).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 103, 86-100 (2016).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+Production+of+Hepatocyte+Like+Cells+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57995 (2018).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Raven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+act+as+Facultative+Liver+Stem+Cells+during+Impaired+Hepatocyte+Regeneration.">Cholangiocytes act as Facultative Liver Stem Cells during Impaired Hepatocyte Regeneration.</a> Nature. 547 (7663), 350-354 (2017).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism.">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+High-Fidelity+Hepatotoxicity+Models+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Developing High-Fidelity Hepatotoxicity Models from Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55355 (2017).</li><li>Villarin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Supported+Directed+Differentiation+Reveals+a+Unique+Gene+Signature+Predicting+Stable+Hepatocyte+Performance.">Polymer Supported Directed Differentiation Reveals a Unique Gene Signature Predicting Stable Hepatocyte Performance.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1820-1825 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li></ol>

David C. Hay, Stemnovate Ltd.'nin kurucu ortağı ve hissedarıdır. Yazarların geri kalanı, bu makalede tartışılan konu veya materyaller hakkında herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belgelemektedir.

Pluripotent kök hücrelerden büyük ölçekte insan hepatik progenitör hücrelerin üretilmesi, kadavradan elde edilen malzemeye umut verici bir alternatifi temsil edebilir. Protokol standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği, biyomedikal araştırmalar için teknoloji çevirisi ve etkisi sağlamak için anahtardır. Bunu ele almak için, önceki çalışmalar tanımlanmış katkı maddeleri ve matrisler 15 , 23 , 24 ,25,26,27,28kullanarak hESC ve iPSC'lerden adım adım bir farklılaşma protokolü geliştirmeye odaklanmıştır. Bunu yaparak, hepatosit fenotip ve tekrarlanabilirlik geliştirilmiştir, farklılaşma sürecinin yarı otomasyona izin verilir19. Sunulan sistem, raf dışı hücre kültürü ortamı ve facile hepatosit farklılaşma sistemi ile kombinasyonu ile güçlendirilmiştir.
Daha önce, farklılaşma protokolü başlamadan önce pluripotent hücre yoğunluğu, hepatik progenitör hücrelerin homojen popülasyonunu elde etmek için anahtar bir değişken olarak vurgulanmıştır26. Bu daha rafine prosedürü kullanarak, bir dizi başlangıç hücresi yoğunluğu kullanarak adım adım çok sayıda kök hücre türevi hepatik progenitör oluşturmak mümkündür (Tablo 1). 5. günde, kesin endoderm indüksiyonu Sox17 boyama ile doğrulandı (Şekil 3). Kesin endoderm içine verimli ve sağlam farklılaşma hem test esc hem de iPSC hatları ile elde edildi, fazla ifade 80% Sox17 (Şekil 3). 10. günde, hepatik progenitörler tek tip parke taşı benzeri bir morfoloji sergilediler ve karaciğer kök hücre belirteçleri hem AFP hem de HNF4α için oldukça zenginleştirilmişti (%>86, Şekil 4). Manuel ve yarı otomatik teknolojilerin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla plaka formatında farklılaşma gerçekleştirmek mümkündü19.
Mevcut haliyle, hücre farklılaşması in vitro bazlı deneyler için uygundur. Bununla birlikte, homojen bir hepatik progenitör popülasyonunun doğuma hazır olduğundan emin olmak için klinik uygulamadan önce hücre zenginleştirmesi gerekecektir.
Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, alana büyük ölçekte hepatik atalar üretmek için standart bir yaklaşım sağlar. Gelecekteki çalışmalar, sonraki HLC farklılaşması, olgunlaşması ve bakımı için yeni bir ortamın üretimine odaklanacaktır.

Karaciğer hastalığı küresel bir sağlık zorluğunu temsil eder ve dünya çapında yılda yaklaşık 2 milyon ölüme neden olur1. Hepatik hastalıkları incelemek ve klinik olarak müdahale etmek için bir dizi model sistemi mevcut olsa da, hücre bazlı sistemlerin rutin kullanımı önemli dezavantajlarla sınırlıdır (bir inceleme için bkz. Szkolnicka vd.2). Gelişmiş insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültürü ve somatik hücre farklılaşmayöntemleri,klinik için temel biyomedikal araştırmalar ve farklılaştırılmış hücrelerin yenilenebilir kaynakları için araçlar geliştirmek için umut verici teknolojileri temsil eder3,4.
Bugüne kadar, hepatosit benzeri hücre (HLC) farklılaşması için birden fazla protokol geliştirilmiştir5,6,7,8. Bu protokoller, küçük moleküller ve büyüme faktörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak insan karaciğer gelişiminin yönlerini yeniden yaratmaya çalışır9,10. Çoğu protokol, hPSC'lerin kesin endoderm için astarlandığı, ardından hepatik progenitör spesifikasyonu11 , 12,13ve HLC spesifikasyonu ile biten adımsal bir farklılaşma işleminden oluşur. Bu protokoller tarafından üretilen HLC'ler fetal ve yetişkin fenotiplerinin bir karışımını gösterir. Bu, HNF4α ve albümin (ALB) gibi hepatosit belirteçleri gibi alfa fetoprotein (AFP) ifadesinin yanı sıra14 , 15,16ilaç metabolizasyon kapasitesini içerir. Laboratuvarlar arasında HLC farklılaşması değişebilir; bu nedenle, standartlaştırılmış protokollerin geliştirilmesi gereklidir. Bu, araştırmacıların kök hücre türevi HC'leri temel ve klinik araştırmalar için büyük ölçekte etkili bir şekilde üretmelerini ve uygulamalarını sağlayacaktır.
Takip edilmesi kolay kılavuzlar kullanılarak hem insan embriyonik hem de indüklenmiş pluripotent kök hücre hatlarına uygulanabilen hepatik progenitör farklılaşma sistemi geliştirilmiştir. Bu prosedür, hücre kültürü şişelerinden 96 kuyu plakasına kadar değişen kültürsel formatlarda homojen hepatik progenitör popülasyonları verir. Aşağıda kök hücre türevi hepatik progenitörlerin 24 ve 96 kuyu formatlarında üretilmesi protokolü verilmiştir.
Aşağıda sunulan protokolde kullanılan hücre yoğunluğu sırasıyla 24 ve 96 kuyu plakasının bir kuyusu için belirtilmiştir (bkz. Tablo 1). Farklı hücre kültürü plaka biçimleri ve hücre çizgileri için başlangıç hücre numarasının en iyi duruma getirilmesi gerekir. Protokol optimizasyonu için önerilen başlangıç hücresi yoğunluğu 2 x 105 hücre/cm2'dir. Yoğunluk optimizasyonu için, aynı anda 50.000 hücre/cm2 ± eklenerek birkaç hücre yoğunluğu test edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:719px;" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14040133</td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342 Ready Flow Reagent</td>
			<td style="width:171px;">thermofisher</td>
			<td>R37165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Endoderm Basal Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Hepatic Progenitor Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Antibodies</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td style="width:107px;">1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td style="width:107px;">1:400 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HNF-4&#945;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">IgG</td>
			<td style="width:171px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sox17</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1:200 (Goat)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">Columbus Image Data Storage and Analysis system</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hepatic progenitor specification from pluripotent stem cells using a defined differentiation system

Karaciğer hastalığı küresel sağlık sorunudur. Karaciğer nakli etkili bir tedavi şekli olmakla birlikte, donör organ mevcudiyetindeki eksiklikler nedeniyle hasta ölümleri artmıştır. Organ kıtlığı, temel araştırmalar ve klinik için insan hepatositlerinin rutin tedarikini de etkiler. Bu nedenle, insan karaciğeri progenitör hücrelerinin yenilenebilir kaynaklarının geliştirilmesi arzu edilir ve bu çalışmanın amacıdır. İnsan karaciğer atalarını büyük ölçekte etkili bir şekilde üretebilmek ve konuşlandırabilmek için tekrarlanabilir bir hepatik progenitör farklılaşma sistemi geliştirilmiştir. Bu protokol, çeşitli hücre kültürleri formatlarında kullanıcılar arasında deneysel tekrarlanabilirliğe yardımcı olur ve hem insan embriyonik hem de indüklenmiş pluripotent kök hücre çizgilerini kullanarak farklılaşmalara izin eder. Bunlar, temel araştırmaları geliştirecek ve klinik ürün geliştirmeye giden yolu açabilecek mevcut farklılaşma sistemlerine göre önemli avantajlardır.

Şekil 2'deaçıklanan adım adım protokolün ardından hem hESC (H9) hem de hiPSC (P106) çizgilerinden hepatik progenitör farklılaşması gerçekleştirildi. Burada pluripotent kök hücreler, farklılaşma başlamadan önce LN-521 kaplı plakalara tek hücre olarak tohumlandı. Hücre konflüensi, sağlam ve tekrarlanabilir bir farklılaşmanın anahtarıdır. Doğru izdiah sağlandıktan sonra (Şekil 2), farklılaşma başlatılmıştır. 5. günde, kesin endoderm spesifikasyonu Sox17 ifadesi ile değerlendirildi. Her iki hücre hattında da Sox17, H9 ve P106 için sırasıyla %80 ± %0,5 ve %87,8 ± Sox17 pozitif hücrelerin %0,5 SEM'i ile yüksek oranda ifade edildi (Şekil 3). 10. günde, hepatik progenitörler parke taşı benzeri bir morfoloji sergilediler (Şekil 2). Ek olarak, hepatik progenitör spesifikasyonu HNF4α, AFP, ALB ve sitokeratin-19 (CK19) ekspresyonlarının yanı sıra AFP ve ALB protein salgısı10,15,22 (Şekil 4)için değerlendirildi. Hem H9 hem de P106 hepatik progenitör kültürleri HNF4α (%91 ± %0,5 ve %90 ± %0,2), AFP (%89,7) gibi fetal hepatik belirteçleri ifade etti. ± %1,8 ve %86 ± %1,2) ve CK19 (%78,5 ± %3,2 ve 83,6 ± %1,8)(Şekil 4). Her iki hücre hattında da 10. günde AFP salgısı saptanmıştır (32.4 ± 1.6 ve 47.8 ± 5.9 ng/mL/mg/24 h) (Şekil 5). Albümin sentezi daha düşük seviyelerde gözlenmiştir (%30,7 ± %1,8 ve %27,2 ± %1,1) (Şekil 4) ve ELISA(Şekil 5)ile tespit edilmelidir.
Protokol, 24 kuyudan 96 kuyu plakasına kadar hepatik progenitörlerin standart üretimine izin verildi. Daha önceaçıklandığıgibi H9 ve P106 hücre hatlarından 96 kuyu plakası hepatik progenitör üretmek için yarı otomatik bir boru hattı kullanıldı. Hücre sayısı değişkenliği ve hepatik progenitör farklılaşma verimliliği HNF4α ekspresyonunun niceliği ile değerlendirildi. Yüksek içerikli bir görüntüleme cihazı kullanılarak immünofluoresans yoluyla protein nicelemesi için hücre segmentasyonu gerçekldir (Şekil 1). 10. günde, hepatik progenitörler, H9 için kuyu başına HNF4α pozitif hücrelerin% > 94'ü ve P106 için% 97 HNF4α pozitif hücrelerin% 94'ü ile satırlarda önemli bir değişkenlik göstermedi (Şekil 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2.jpg"> Şekil 1: Hücre segmentasyon ardışık düzenine genel bakış. (A) Orijinal görüntü kullanılarak, (B) çekirdek segmentasyonu için nükleer boyama kullanılmıştır. (C) Sadece açıkça segmente edilmiş çekirdekleri ölçmek için şekil ve boyuta dayalı bir nükleer segmentasyon kalite kontrol adımı gerçekleştirildi. (D) Bundan sonra pozitif HNF4α lekeli çekirdekler ölçüldü. (E) Son olarak, HNF4α ekspresyoz hücrelerini tanımlamak için yoğunluğa dayalı bir eşik kullanıldı. C ve E'de yeşil çekirdekler seçili hücreleri temsil eder ve macenta çekirdekleri atılan hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2.jpg"> Şekil 2: Hepatik progenitör farklılaşması hPSC'lerden. (A) Hepatik progenitör farklılaşma protokolünün şematik gösterimi. (B) Farklılaşma sırasında morfolojik değişiklikleri vurgulayan temsili görüntüler. 0. günde (D0), hPSC'ler paketlenmiş bir hücre monolayer sundu. Bunu takiben, hPSC'ler 5. günde (D5) kesin endoderm haline getirildi. Bunu 10. günde hepatik progenitör farklılaşması izledi (D10). Hepatik progenitörler parke taşı benzeri bir hücre morfolojisisergilediler. Ölçek çubuğu = 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2.jpg"> Şekil 3: Kesin endoderm spesifikasyonunun karakterizasyonu. 5. günde, hücreler kesin bir endoderm belirteci olan Sox17 için lekelendi. Sox17 pozitif hücrelerin yüzdesi H9 için %80 ± %0,5 ve P106 için %0,5 ± 87,8 idi. Yüzde nicelemesi, kuyu başına 6 görüş alanına sahip 10 ayrı kuyuya dayanıyordu. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3.jpg"> Şekil 4: Hepatik progenitör karakterizasyonu. 10. günde hepatik progenitörler hepatik belirteçler (A) HNF4α, (B) AFP ve (C) ALB için lekelendi. H9 için pozitif hücrelerin oranı sırasıyla %91 ± %0,4, %89,7 ± %1,8 ve %30,7 ± HNF4α, AFP ve ALB için %1,8 idi. P106 için pozitif hücrelerin yüzdesi sırasıyla %90 ± %0,2, %86 +/- %1,2 ve %27,2 ± HNF4α, AFP ve ALB için %1,1 idi. (D) Kolanjiosit soy potansiyeli CK19 ekspresyosu ile değerlendirildi; H9 türevi hepatik progenitörler %78,5 ± %3,2 CK19 pozitif hücre ifade ±, P106 hepatik progenitörler için ise %83,6 ± CK19 pozitif hücrelerin %1,8'i gözlenmiştir. İmmünoglobulin G (IgG) lekelenme, boyama kontrolü olarak kullanıldı. Yüzde nicelemesi, kuyu başına 6 görüş alanına sahip 10 ayrı kuyuya dayanıyordu. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig5.jpg"> Şekil 5: Hepatik progenitör protein salgı analizi. Alfa fetoprotein (AFP) ve albümin (ALB) salgılanması H9 ve P109'da 10. Veriler üç biyolojik çoğalı temsil eder ve hata çubukları SD'yi temsil eder. Salgılanan proteinler, protein mg başına mL başına salgılanan protein nanogramı olarak 24 saat kültür ortamından ölçülür, n = 3; ND = algılanmadı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2.jpg"> Şekil 6: 96 kuyu plakasında kuyudan kuyuya değişkenliğin değerlendirilmesi. (A) HNF4α ile boyanmış H9 türevi hepatik progenitörlerin 96 kuyu plakası görünümünün görselleştirilmesi. (B) HNF4α pozitif hücrelerin nicelemesi. İyi ölçülen her altı görünüm alanından satır başına hücre sayısı ortalaması. Plaka genelinde ortalama hücre sayısı kuyu başına 0.22 SEM HNF4α pozitif hücre ± %94.81 idi. Kuyular arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi. (C) HNF4α ile boyanmış P106 türevi hepatik progenitörlerin 96 kuyu plakası görünümünün görselleştirilmesi. (D) HNF4α pozitif hücrelerin nicelemesi. Kuyu başına altı görünüm alanından satırlardaki kuyu başına ortalama hücre sayısı ve nicel. Plaka genelinde ortalama hücre sayısı kuyu başına 0.57 SEM HNF4α pozitif hücre ± %97.7 idi. Satırlar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi. H12, Immunoglobulin G (IgG) boyama kontrolü olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu = 1 mm. Tukey'in post-hoc istatistiksel testleri ile tek yönlü ANOVA kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Plaka biçimi</td>
			<td>Yüzey alanı (cm2)</td>
			<td>Cm2 başına hücreler</td>
			<td>Kuyu başına toplam hücre sayısı</td>
			<td>Dağıtım hacmi (mL)</td>
			<td>Hücre konsantrasyonu (hücreler/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 kuyulu tabak</td>
			<td>1.9</td>
			<td>210526</td>
			<td>400000</td>
			<td>0.5</td>
			<td>800000</td>
		</tr>
<tr>
<td>96 kuyu plakası</td>
			<td>0.32</td>
			<td>187500</td>
			<td>60000</td>
			<td>0.05</td>
			<td>1200000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Bu protokolde kullanılan hPSC hücre hatları için farklı plaka formatları için önerilen hücre yoğunluğu.

Watch this Scientific Journal Video about Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System at JoVE.com

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Bu makalenin amacı, insan hepatik progenitörlerin pluripotent kök hücrelerden farklılaşmasına neden olmak için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlamaktır. Bu prosedürün kullanıma hazır ortam formülasyonları ile geliştirilmesi, kullanıcıya biyomedikal araştırma ve çeviri için insan karaciğer hücreleri üretmek için bir facile sistemi sunmaktadır.

Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

hepatic-progenitor-specification-from-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

4.6K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Bu makalenin amacı, insan hepatik progenitörlerin pluripotent kök hücrelerden farklılaşmasına neden olmak için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlamaktır. Bu prosedürün kullanıma hazır ortam formülasyonları ile geliştirilmesi, kullanıcıya biyomedikal araştırma ve çeviri için insan karaciğer hücreleri üretmek için bir facile sistemi sunmaktadır.

Video: Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Biyoloji

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

hiPSC Kullanan MSC'lerde Yüzey Antijenlerinin ve Proliferasyon Yeteneğinin Karakterize Edilmesi

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

Yazar Spotlight: iPSC'lerdeki Gelişmeler ve Genetik Hastalık Araştırmaları 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...