ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

このプロトコルは、ヒト血原性内皮細胞の十分に特徴付けられた集団を生成する方法を詳述する。これらの細胞は、分子調節および内皮から造血への移行を研究するために利用することができる。まず、ヒト胚性幹細胞を4日間培養し、始原内皮細胞に分化させます。

5日目に、細胞の上に培地を吸引します。次に、ウェルあたり1ミリリットルのDMEM / F-12で細胞を穏やかに洗浄します。ウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地を加え、摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間細胞をインキュベートします。

6日目および7日目に、細胞の上の培地をウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した均質な内皮細胞分化培地と交換し、細胞をさらに24時間インキュベートします。8日目。細胞を剥離して洗浄した後、氷上の微量遠心チューブに均等に分割し、それぞれが1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍の密度で最低600マイクロリットルの細胞を含みます。

必要に応じて細胞を含むチューブに抗体を加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。1000倍Gおよび摂氏4度で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を除去し、ペレットを600マイクロリットルの氷冷選別バッファーに再懸濁します。

5ミリリットルのFACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保存して、細胞を即座に選別します。FACSによって血原性内皮細胞を単離するには、まずCD45陰性細胞集団をゲートする。次にCD45陰性集団内で、CD31陽性細胞をゲートする。

次にCD31陽性集団内で、VEカドヘリン陰性細胞集団のためのゲート。そして、VEカドヘリン陰性集団内で、c-Kit陽性細胞のゲート。c-Kit陽性集団から、CD34陽性細胞集団をゲートする。

そして最後にCD34陽性細胞集団から、KDR陽性細胞を同定・採取する。造血前駆細胞の増殖のために処方されたメチルセルロースベースの培地に血原性内皮細胞を播種した後、コロニー形成ユニット-赤血球コロニー、およびいもち病形成ユニット-赤血球コロニーを8日目にカウントします。コロニー形成ユニット-顆粒球-マクロファージおよびコロニー形成ユニット-顆粒球、赤血球、マクロファージ、およびメガカリオサイト。

多能性造血前駆細胞コロニーは14日目にカウントされます。播種された1000個の血原性内皮細胞当たり、約20個のコロニー形成単位が生成される。内皮細胞形態を有する細胞も培養物中に見える。

これらは、単一細胞レベルで多系列造血前駆細胞を生じさせる血原性内皮細胞です。このプロトコルは、約1週間でヒト血原性内皮細胞を作製できる2D血清およびマウスフィーダーフリー培養システムです。