無機ポリリン酸は、細菌ストレス応答の重要な要素です。しかし、細菌中のpolyPを抽出して測定するための古い方法は複雑で労働集約的です。この技術の主な利点は、さまざまな細菌種におけるポリPレベルの迅速、敏感、および安価な定量化を可能にすることです。
この手順は、私の研究室の学部生であるアーヤ・ポクラルによって実証されます。まず、一晩で37°Cでシスチンを含まないリンゴ酸菌の尿酸菌を成長させます。遠心この一晩培養物の1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで、合計50〜100マイクログラムの細胞タンパク質を得るのに十分な細胞を収穫する。
細胞ペレットから上澄み液を完全に取り出し、250マイクロリットルのGITCライシスバッファーを加え、ボルテックスで再中断します。細胞をライスするために摂氏95度で10分間インキュベートします。ライセートを摂氏80度で保存します。
まず、GITCのリシスバッファーに1ミリリットル当たり0、1、2、4ミリグラムを含むBSA規格を調製します。アリコート5マイクロリットルの解凍、よく混合された細胞ライセート、および5マイクロリットルのBSA標準は、明確な96ウェルプレートでウェルを分離する。ブラッドフォード試薬195マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートリーダーで595ナノメートルで吸光度を測定します。
原稿に概説されているBSA標準曲線と比較して、各ウェルのタンパク質量を計算します。各サンプルのタンパク質の総量を求めるには、結果の値に05を掛けます。ポリリン酸抽出を開始するには、各GITC lysedサンプルに95%エタノールの250マイクロリットルを加え、渦を混ぜ合わせます。
この混合物を1.5ミリリットルの遠心管に入れたシリカ膜スピンカラムにピペットする。遠心分離機は16、100gで30秒間。流れを捨て、トリス塩酸塩、塩化ナトリウム、EDTA、およびエタノール混合物の750マイクロリットルを加えます。
16で遠心分離機、30秒間100 gs。流れを捨て、スピンカラムを16、100 gsで2分間遠心分離します。カラムを清潔な1.5ミリリットルマイクロフュージチューブに入れる。
50ミリモルpH 8トリス塩酸塩の150マイクロリットルを追加し、5分間室温でインキュベートします。8,000gで2分間遠心分離してポリPを溶出する。50ミリモルpH 8トリス塩酸塩で0、5、50、または200マイクロモルリン酸カリウムを含む標準を準備することによって開始します。
アリコート 100 マイクロリットルの各リン酸塩標準と 100 マイクロリットルの抽出された polyP サンプルを、クリアな 96 ウェル プレートの別々のウェルにします。サンプルごとに、30マイクロリットルの5X ScPPX反応バッファー、19マイクロリットルの水、および精製されたScPPXの1マイクロリットルを含むマスターミックスを準備します。
そして、摂氏37度で15分間インキュベートします。検出日に、検出溶液ベース9.12ミリリットルで1モルアスコルビン酸88ミリリットルを混合して検出液の新しい作業ストックを調製し、使用前に室温に来るようにします。96ウェルプレートの各サンプルと標準に50マイクロリットルの検出溶液を追加します。
色の発生を可能にするために、室温でプレートを約2分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して882ナノメートルで吸光度を測定し、リン酸カリウム標準曲線と比較して各サンプルのリン酸濃度を計算します。次に、リン酸濃度を各細胞のリセート中のポリP由来リン酸のナノモルに変換し、原稿に記載されているように細胞内のポリP含有量を全細胞タンパク質に正常化する。
野生型大腸菌は、グラム陰性細菌であり、LBで増殖し、ポリPを産生しなかった。しかし、MOPSで増殖すると、総タンパク質の1ミリグラムあたり約192ナノモルポリPを産生した。ポリPキナーゼを欠く大腸菌デルタppk変異体は、いずれの媒体でもポリPを産生しなかった。
エキソポリホスファターゼを欠くデルタppx変異体は、野生型とほぼ同じ量のpolyPを産生した。そして、リン酸輸送に欠陥があるデルタ・フォB突然変異体は、野生型よりも有意に少ないポリPを産生した。野生型L.reuteriは、MEIC培地で一晩成長したグラム陽性細菌で、総タンパク質の1ミリグラムあたり約51ナノモルポリPを蓄積した。
PolyPキナーゼを欠いたL.reuteri ppk1ヌル突然変異体は、この量の半分以下を含んでいた。ppk1ヌル変異体におけるこのポリPの存在は、おそらく第2のポリPキナーゼを含むL.reuteriによるものである。マイコバクテリウムスメグマティス株SMR5は、エタノールの不在時にハートマンス・ド・ボン培地で増殖し、全タンパク質の1ミリグラム当たり約141ナノモルポリPを蓄積した。
エタノール処理の結果、3倍の増加が生じる。この手順に従って、アクリルアミドゲル電気泳動を行い、polyP鎖長の差を評価することができる。この手順を試みる際には、よくある間違いを避けてください。
マイクロタイタープレートウェルに泡を入れないようにし、カラムからマイクロフュージチューブに切り替えるときにサンプルを適切なチューブに移すので注意してください。GITCや強酸での作業は危険であり、この手順を実行している間は常に適切な保護具を着用する必要があることを忘れないでください。
