この方法は、研究者がミトコンドリア機能とは無関係に細胞生存率を評価することを可能にする。そして、それは高いスループットの薬物スクリーニングの努力に適しています。この技術は、速く、正確で、安価であり、ほとんどの細胞タイプにおけるミトコンドリア機能を損なうものを含む、細胞毒性の化合物の決定を可能にする。
このプロトコルは簡単に実行できます。実験の正確性と有効性を確保するためには、薬剤の調製、治療条件、および細胞密度に注意を払うことが重要です。特にGen5 Softwareの経験がほとんどない研究者にとっては、画像取得や画像解析の手順を再現することは困難であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。
目的の濃度で目的の化合物の溶液を調製して開始します。常に徹底的に渦をかかすことによって化合物を混合するようにしてください。単一化合物の細胞毒性を測定するために、2倍の最終濃度で化合物を調製する。
化合物の組み合わせの細胞毒性を測定する場合は、4倍の最終濃度で調製する。適切な培地と同量の溶媒を混合して、制御する溶媒のみを調製する。細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、細胞懸濁液の10マイクロリットルをアリコートします。
トリパンブルー染色の場合は、0.4%トリパンブルーの10マイクロリットルをアリコートに加え、ヘモサイトメーターまたはセルカウンターを使用して生存細胞と生存不可能な細胞をカウントします。15ミリリットルチューブ中のペレット細胞をGの200倍で5分間、吸引または脱キャンプした。1ミリリットル当たり5番目の細胞の3倍の10倍の細胞密度で、エッセイ適当な培地中の細胞ペレットを懸濁させる。
マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルのセル懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに播種します。単一化合物アッセイの場合、2X化合物溶液を50マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。溶剤制御ウェルの場合、2X濃度で溶媒を含む試験培地を15マイクロリットル添加します。
併用アッセイの場合、各ウェルに各4X化合物の25マイクロリットルを加えます。単一化合物制御ウェルの場合、4X化合物溶液および試験培地をそれぞれ25マイクロリットル添加します。DMSOの最終濃度が0.5%を超えていないことを確認して再現性を確保するために、ピペットチップがウェルの側面に触れる薬を添加してください。
異なる場所に薬を追加するように注意してください。この刺し傷は非常に迅速に行われるべきであり、好ましくはプレートあたり30分以下で済む。プレートを軽くタップして井戸の内容物を混ぜ、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。
Hoechst 33342とヨウ化プロピジウムで細胞を染色する準備ができたら、新鮮な10倍の染色液を調製し、各ウェルに10マイクロリットルを加えます。プレートを軽くタップし、摂氏37度で15分間インキュベートします。プレートを200倍Gで4分間遠心し、すべての細胞をプレートの底に持ち込みます。
その後、慎重に湿った実験室のワイプでプレートの底を拭き取り、イメージングを妨げる可能性のある破片を取り除きます。遠心分離後15分以内にプレートをイメージします。Gen5ソフトウェアを開き、新しい標準プロトコルを作成し、手順をクリックして、使用するプレートの種類を選択します。
通常、96ウェル黒いプラスチックプレート。次に、読み取り方法をイメージに設定し、[はい]をクリックして、4X 倍率の目標を持つ DAPI とテキサスレッドフィルタセットを選択します。ウェルセンターがイメージ化されるため、オフセットは必要ありません。
DAPI フィルターの場合は、LED を 10 に、統合時間を 99 に設定し、ゲインをゼロに設定します。テキサスレッドの場合は、LEDを8に、統合時間を950に設定し、ゲインを18に設定します。[オプション] をクリックして、DAPI チャネルでオート フォーカスが実行され、チャネル間のフォーカスにオフセットがないことを確認します。
[OK] をクリックしてプロトコルを保存します。今すぐ画像は、新しい読み取りボタンを使用して記録することができます。画像が記録されたら、[データ削減]をクリックして、[画像の前処理]を選択します。
DAPI信号に基づいて自動平坦化サイズを使用して、暗い背景減算で画像前処理を適用します。テキサスレッドの場合は、チャンネル1と同じオプションを使用します。完了したら、[はい] をクリックします。
次に、セルラー分析パネルに移動し、6,000単位のしきい値、5マイクロメートルの最小物体サイズ、最大物体サイズ25マイクロメートルの変換されたDAPI信号に基づいて核マスクを適用します。画像全体を解析し、画像の境界上のプライマリエッジオブジェクトを除外し、接触するオブジェクトを分割します。詳細検出オプションでは、ローリングボールの直径を30マイクロメートルに設定し、最低ピクセルの5%に基づいて背景を評価します。
計算されたメトリックのセル数のみを保持します。その後、平均変換テキサスレッド信号に基づいて、死んだ細胞を数えるために5,000単位のしきい値を使用してサブ人口分析を実行します。最後に、結果のセル数にアクセスします。
Hoechstで染色された細胞の代表的な画像は、ヨウ化プロピジウムをここに示す。セルの総数は、死んだ細胞の数よりもかなり多く、より多い。細胞毒性アッセイのパネルをトリパンブルー排除と比較したところ、MTTとアラマーブルーアッセイが細胞の生存率を不正確に測定していることが判明した。
これらのミトコンドリア酵素ベースのアッセイは、トリパンブルー排除に比べて有意に低い生存率を示した。Hoechst 33342とPIによる二重染色は、CCPまたは2-DG処理後のトリパンブルー染色およびトリパンブルー排除法からの最小中央値偏差との堅牢性、感度、および一貫性の最良の組み合わせを有していた。Hoechst PIエッセイは、ミトコンドリア標的分子ロテノーネと3つのブロモピルビン酸で治療後の細胞生存率を決定するのにも有効であった。
さらに白血病細胞株のパネルで検証されました。.これらの細胞は、非常に感受性から抵抗細胞に及ぶロテノーネ感受性で変化した。アッセイの性能が不適切な場合、その精度が損なわれる可能性があります。
いくつかの妥協された結果がここに示されています。PIで過染色したり、遠心分離ステップを無視したり、Hoechstチャネルで過度に露出したりすると、最適でない結果が生じます。このプロトコルのタイミングを設定しながら、各細胞株の色素濃度と染色時間を最適化することを忘れないでください。
また、サンプルプレートの中心は、イメージング品質を確保するために必要である。癌細胞に対する細胞毒性効果の化合物を同定した後、研究者は、その関連するターゲットを同定するために、機械学的研究を進めるかもしれない。この技術を用いて小分子ライブラリーを従来のMTTアッセイと並行してスクリーニングすることで、ミトコンドリア機能を標的とする分子を迅速に同定できるようになる。
