著者らは、この技術の開発に対するベス・チャフィー博士、DVM、PhD、DACVPの重要な貢献を認めています。

記載されているすべての動物実験は、英国ケンブリッジのケンブリッジ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 細胞株の調製
<ol><li>従来の細胞培養またはマウスへの注射のためのラボの標準的な細胞培養プロトコルに従って細胞株を増殖させます。ここで使用される標準プロトコルは、10%ウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(以下、完全増殖培地と呼びます)での増殖です。 注:この実験では、エイブラムス骨肉腫細胞をBalb / c Foxn1 nu / nu マウスで使用しました。乳がん研究では、Balb / cマウスの4T1細胞とC57BL / 6マウスのEO771細胞が使用されます。</li>
	<li>通気組織培養フラスコまたは6ウェル組織培養プレートのいずれかで、5%CO2中で37°Cで細胞を増殖させます。</li>
	<li>目的の細胞株を継代し、細胞がマウスへのこれらの細胞の注射で一般的に使用されるコンフルエントに達したら、注射用の細胞を準備します。</li>
</ol>2.動物
<ol><li>皮下腫瘍の生成に少なくとも6〜8週齢のBalb / c Foxn1 nu / nu マウスを使用して、動物が急速な成長段階を超え、成体期および骨格の成熟を達成していることを確認します。</li>
	<li>オスまたはメスのマウスを使用してください。ホルモン応答性細胞株(例えば、雌マウスの乳癌細胞および雄マウスの前立腺癌細胞)を選択するときは例外を設けてください。</li>
	<li>異種移植片の実験には、通常の条件下では無傷のマウス免疫系と互換性がないことに基づいて、免疫不全の無胸腺ヌードマウスを使用します。</li>
	<li>マウス細胞株を用いた同種移植実験では、異なるマウスの遺伝的背景と免疫的背景に基づいて、これも推奨されます。しかしながら、同系実験のためには、目的の細胞株と同じ株の動物を使用する。</li>
	<li>施設の飼育方針に応じた標準的な密度で動物を飼育します。</li>
</ol>3.皮下腫瘍
<ol><li>トリプシン処理によって培養物から細胞株を回収し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。</li>
	<li>細胞の生存率を評価し、トリパンブルー排除法によって細胞密度を決定します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。90%の最小細胞生存率は、皮下腫瘍を作成するためのマウスへの注射に使用されます。</li>
	<li>細胞密度を調整して、1〜2 x 105 個の細胞を0.1〜0.15 mL(100〜150 μL)の滅菌PBSの最終容量に注入します。注射まで細胞を氷上に保ちます。</li>
	<li>あるいは、800 x g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を廃棄し、ペレット化した細胞を希釈していない滅菌基底膜マトリックス培地に再懸濁して、最終容量0.1〜0.15 mL(100〜150 μL)の1〜2 x 105 細胞を得ます。さらに使用するまで細胞を氷上に保管してください。</li>
	<li>酸素麻酔でイソフルランによる皮下腫瘍増殖に使用するマウスを麻酔する。2 L /分の酸素中に5%イソフルランの誘導用量を使用し、2 L /分の酸素中に2〜3%イソフルランの維持用量を使用します。.先に進む前に、まばたきやペダルの反射神経がないかどうかを確認してください。 注:イソフルランは吸入麻酔薬です。.イソフルランは、適切な掃気および遊離ガス収集システムを備えた換気の良い場所で使用してください。麻酔の導入、維持、および監視の計画を策定するために施設の獣医スタッフと相談し、検査室のスタッフが麻酔モニタリングと吸入麻酔薬の取り扱いについて適切なトレーニングを受けていることを確認してください。</li>
	<li>麻酔をかけたマウスの胸部または腹部の背側領域から脱毛液または電気バリカンで毛髪を除去する。脱毛溶液は、皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために好ましい。無胸腺ヌードマウスを使用する場合は、この手順をスキップしてください。</li>
	<li>細胞懸濁液を注入する前に、調製した領域を70%エタノール綿棒で洗浄する。</li>
	<li>27 Gの針が付いた1 mLのツベルクリン注射器を使用して、肩甲骨の動きの影響を受けないように、胸部または腹部の背部に細胞を皮下注射します。あるいは、市販の細胞外マトリックスに懸濁液として細胞を皮下注射する。 注:市販の細胞外マトリックスへの注射は、これらのマトリックスが室温で固化するため、皮下空間での細胞懸濁液の移動を制限します。</li>
	<li>歩行可能になるまで、個々のケージの加熱パッドでマウスを回収します。その後、マウスは清潔で乾いた寝具を備えた通常のケージに入れることができます。</li>
	<li>背胸部または腹部を覆う皮下腫瘍のサイズをノギスで監視し、毎週体重を測定して、皮下腫瘍が潰瘍化していないこと、またはマウスが施設の動物管理および使用委員会によって確立された早期除去基準を満たしていることを確認します。皮膚潰瘍や中枢性腫瘍壊死のリスクを減らすために、任意の寸法で最大15 mmの腫瘍サイズが推奨されます。 注:地域のガイドラインを参照して、最大許容腫瘍サイズ/体積を決定してください。</li>
	<li>3〜4週間後に皮下腫瘍を有するマウスをCO2 吸入とそれに続く頸部脱臼により安楽死させる。マウスの安楽死に関する機関の許容可能な方針に従ってください。</li>
	<li>無菌手術技術を使用して皮下腫瘍を採取します。脱毛後、以前と同様に腫瘍の上にある皮膚を70%エタノールで滅菌します(該当する場合)。#15メスの刃(メスの刃のハンドルの有無にかかわらず)で腫瘍の上にある皮膚を切開します。滅菌外科用ハサミで周囲の付着軟部組織から腫瘍を鋭く解剖します。</li>
	<li>腫瘍を完全増殖培地を含む6ウェル組織培養プレートに入れ、#15メス刃(メス刃ハンドルの有無にかかわらず)で、事前に決定されたサイズ(~0.6 mm x 0.6 mm x 0.6 mm – 0.25 mm、3、最大1 mm x 1 mm x 1 mm– 1 mm3)の複数の小さな断片に細刻します。</li>
	<li>脛骨内移植時まで、室温で滅菌完全増殖培地中の腫瘍断片を維持します。ルシフェラーゼまたは蛍光レポーター遺伝子を有する細胞株の場合、マウスへの脛骨内移植の前に、ex vivo生物発光または蛍光イメージングを使用して腫瘍の生存率を確認します。</li>
	<li>凍結保存のために、20%FBSおよび10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加した完全増殖培地中の同じクライオバイアルに複数のフラグメントを配置します。市販の凍結保存システムを使用して–80°Cで徐々に凍結し、液体窒素で長期間保存します。液体窒素浸漬を使用した急速凍結により、その後の分析のために腫瘍断片を保存しますが、将来の移植のためには保存しません。これらの凍結腫瘍断片は、–80°Cで長期間保管してください。 注:スナップ凍結腫瘍はin vivoで生着および成長しないことが以前に報告されています8。</li>
</ol>4.皮下腫瘍片の外科的移植
<ol><li>外科的移植の前に、皮下腫瘍の新鮮なまたは凍結保存された断片を完全な増殖培地で室温に戻します。</li>
	<li>目的の系統のマウスを、セクション3に記載される酸素麻酔でイソフルランを使用して麻酔する。先に進む前に、ペダル反射の欠如を確認してください。術期鎮痛を提供するために、0.02〜0.05 mg / kgの用量で皮下ブプレノルフィンを投与します。.必要に応じて、術後の期間に6〜8時間ごとにこれを繰り返すことができます。</li>
	<li>皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために、脱毛液で右膝関節と後肢の近位脛骨の毛を取り除きます。</li>
	<li>準備した部分を外科用消毒剤でこすります。最初に70%エタノール綿棒でスクラブし、次にクロルヘキシジンと生理食塩水スクラブを交互にスクラブします。</li>
	<li>近位脛骨を、関節を曲げたり伸ばしたりしながら、膝関節のすぐ遠位にある領域として視覚化します。</li>
	<li>#15メスの刃(メスの刃のハンドルの有無にかかわらず)を使用して、四肢の内側の近位脛骨のレベルで3〜4 mmの切開を作成します。皮膚と皮下組織を切開して、近位脛骨の内側皮質を露出させます。</li>
	<li>25Gの針の先端で軽く圧力をかけ、先端を回転させて、近位脛骨の内側皮質に小さな穴を開けます。この穴を、頭蓋脛骨皮質と尾脛骨皮質の間の等距離の点で膝関節から約2 mm遠位にします。腫瘍片の大きさに応じて針の大きさを選択してください。</li>
	<li>滅菌鉗子を使用して腫瘍片を拾い上げ、近位脛骨の髄腔に挿入します。27〜30 Gの針を使用して、腫瘍断片を髄管に操作します。腫瘍断片のサイズに応じて、各脛骨に最小0.5 mm3 の総腫瘍体積を移植します。これは、作成された腫瘍断片のサイズに応じて、1つ以上の腫瘍断片の移植を必要とする場合がある。 注:骨の外側への移植片の変位を防止または制限するための変更は、骨欠損部への骨ワックスまたは骨セメントの配置、または骨の穴へのゲルフォームまたは皮下脂肪移植のいずれかです。</li>
	<li>滅菌液体組織接着剤または単一の皮膚縫合糸で皮膚の端を任命します。このサイトでは傷付きクリップを使用しないでください。術後に蛍光イメージングを使用する場合は、組織接着剤と縫合糸の両方が蛍光を発する可能性があるため、注意してください。</li>
	<li>歩行可能になるまで、個々のケージの加熱パッドでマウスを回収します。</li>
</ol>5. シリアルおよびエンドポイント評価
<ol><li>前述のように酸素麻酔でイソフルランを使用してマウスを麻酔する。</li>
	<li>毎週のデジタルX線撮影、生物発光、または蛍光イメージング(ルシフェラーゼまたは蛍光レポーター遺伝子を発現する細胞を使用する場合)のいずれかによって、脛骨腫瘍の成長を非侵襲的に評価します。移植部位における四肢のキャリパー測定は、覚醒マウスにおいても行うことができる。</li>
	<li>担癌マウスの従来のモニタリング(体重、活動レベル、呼吸数、グルーミング、姿勢、メンテーション、および行動)に加えて、後肢の跛行、腫脹、および手術部位感染の兆候についてマウスを毎週監視します。</li>
	<li>皮膚の創傷が治癒するまで、最初の10〜14日間、過度の発赤、腫れ、排液、および創傷裂開がないか、皮膚の外科的創傷を監視します。4〜5週間後、生存または安楽死後の研究結果評価に従ってマウスを評価する。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Mouse:+the+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research.">The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li><li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases.">Use of rodents as models of human diseases.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Wolfe, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zoledronic+acid+and+amputation+on+bone+invasion+and+lung+metastasis+of+canine+osteosarcoma+in+nude+mice.">Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinicopathological+features+and+survival+outcomes+of+patients+with+different+metastatic+sites+in+stage+IV+breast+cancer.">The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).</li><li>James, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=metastases+from+breast+carcinoma:+histopathological+-+radiological+correlations+and+prognostic+features.">metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features.</a> British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Chaffee, B. K., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+mouse+model+of+canine+osteosarcoma+with+spontaneous+metastasis.">A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis.</a> In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).</li><li>Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+volume+and+lung+metastasis+in+patients+with+osteosarcoma.">Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma.</a> Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+and+clinicopathological+features+of+osteosarcoma+metastasis+to+the+lung:+A+population-based+study.">Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study.</a> Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).</li><li>Li, W., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+primary+osteosarcoma+and+lung+metastases.">Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases.</a> Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).</li><li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+bone+metastasis.">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).</li><li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+Injection+Causes+Direct+Pulmonary+Seeding+of+Osteosarcoma+Cells+and+Is+Not+a+Spontaneous+Model+of+Metastasis:+A+Mouse+Osteosarcoma+Model.">Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model.</a> Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li><li>Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studying+prostate+cancer+bone+metastasis.">Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis.</a> BoneKey Reports. 5, 777 (2016).</li><li>Marques da Costa, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+in+vivo+orthotopic+bioluminescent+xenograft+models+from+human+osteosarcoma+cell+lines+in+Swiss+nude+and+NSG+mice.">Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice.</a> Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).</li><li>Raheem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+patient-derived+intra-femoral+xenograft+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer+that+recapitulates+mixed+osteolytic+and+osteoblastic+lesions.">A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).</li><li>Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+intrafemoral+injection+with+minimized+leakage+as+an+orthotopic+mouse+model+of+osteosarcoma.">An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma.</a> Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-iliac+Artery+Injection+for+Efficient+and+Selective+Modeling+of+Microscopic+Bone+Metastasis.">Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).</li><li>Kuchimaru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+murine+model+of+bone+metastasis+by+injecting+cancer+cells+through+caudal+arteries.">A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries.</a> Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).</li><li>Haley, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Bone+Metastases+in+Skeletally+Immature+Mice.">Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice.</a> Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).</li><li>Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompromised+and+immunocompetent+mouse+models+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).</li><li>Lefley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+clinically+relevant+in+vivo+metastasis+models+using+human+bone+discs+and+breast+cancer+patient-derived+xenografts.">Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts.</a> Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li></ol>

ヒルドレス博士は、NIHから賞番号K01OD026527で資金提供を受けました。 コンテンツは著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

このレポートは、腫瘍同種移植片の脛骨内移植後の原発性骨腫瘍または骨転移を作成するためのモデルを文書化しています。このプロセスにはいくつかの重要なステップがあると考えています。腫瘍細胞懸濁液の皮下注射と得られた腫瘍断片の脛骨内埋入の両方について、安全な麻酔面を確立する必要があります。皮下同種移植片の除去および同種移植片の脛骨内埋入の両方のための手術部?...

ヒトおよび動物の疾患のマウスモデルは、生物医学研究においてますます人気が高まっています。この文脈でマウスを使用することの有用性は、それらの解剖学的構造と生理学が人間に非常に似ているということです。それらは、成熟を達成するための出生後の生活における妊娠期間と期間が比較的短く、開発または購入のコストの増加は、遺伝子組み換え、免疫不全、および/またはヒト化の程度が高いことに関連していますが、比較的低コストと住居の容易さに大きく関連しています1。近交系株を使用すると、研究に含める前に、ほぼ均一な動物集団が得られます。それらのゲノムの完全な知識は、ヒトとの高度な類似性を示唆しています。多くの疾患プロセスのオーソログ分子標的がマウスゲノムで同定されており、現在、容易に入手できるマウス特異的試薬の広範なライブラリがあります。したがって、それらは、より大きな動物モデルと比較して、より迅速かつ安価な方法で比較的ハイスループット分析の機会を提供します1。さらに、特定の遺伝子の過剰発現または欠失をグローバルに、または細胞型特異的に、および/または構成的または誘導可能な方法で可能にする遺伝子編集戦略の出現により、それらはヒトおよび動物の病気の研究のための非常に生物学的に有用なモデルシステムを表しています2。
がんは、マウスモデルが大きな有用性を持つ分野の1つです。がんの遺伝子マウスモデルは、細胞が発癌性形質転換を受けるために、単独または組み合わせて、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のいずれかの発現の調節に依存しています。マウスへの初代または確立された腫瘍細胞株の注射も行われる。ヒトまたはマウスを含む他の動物種からの細胞株または組織のいずれかの導入は、依然としてin vivoで最も広く使用されている癌のモデルである。免疫不全マウスにおける異種(異種移植片)由来の細胞および組織の使用は、最も一般的に行われている2。しかしながら、宿主およびレシピエントの両方が同じ種のものである同種移植腫瘍細胞または組織の使用は、同系系において同じ宿主マウス系統と組み合わされたときに無傷の免疫系との相互作用を可能にする3。
原発性骨腫瘍または固形腫瘍からの骨転移は、痛みを伴う溶骨性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性病変をもたらします3,4。これらの腫瘍は骨構造を損ない、病的骨折のリスクを高め、患者に限られた治療選択肢を残します。原発性骨腫瘍は遠隔臓器に転移し、一部のタイプは他の骨格部位に広がる可能性があります。乳がん患者では、骨は最初の転移の最も一般的な部位であり、転移性疾患の最も頻繁な最初の症状部位です5,6。さらに、播種性腫瘍細胞(DTC)は、他の臓器の転移の診断前に骨髄に存在し、その発症を予測します7。したがって、骨に存在する癌細胞は、最終的に他の臓器系に転移する細胞の源であると考えられています。固形腫瘍転移の多くのマウスモデルが存在し、主に肺およびリンパ節に転移を発症し、腫瘍の種類および注射技術によっては、潜在的に他の臓器系3。しかし、骨転移のマウスモデルは、マウスが原発腫瘍量または他の臓器への転移からの早期除去基準に達する前に、部位特異的な骨格転移を確実に再現可能に生じ、骨転移を発症するモデルを欠いている。我々は、マウスの近位脛骨への固形腫瘍同種移植の外科的移植に依存する原発性骨腫瘍骨肉腫のモデルを報告した8。骨腫瘍はマウスの100%で形成され、88%が肺転移を発症しました。この転移の発生率は、臨床的に一般的に報告されているもの(~20-50%)を超えていますが、肺が骨肉腫の最も一般的な転移部位であるため、非常に興味深いものです9,10,11。このモデルは原発性骨腫瘍のモデリングに有利ですが、乳房、肺、前立腺、甲状腺、肝臓、腎臓、胃腸腫瘍などの他の骨刺激性固形腫瘍からの骨転移のモデリングにも大きな有用性があります。
このモデルの開発の理論的根拠は、原発性骨腫瘍または骨転移をモデル化するために、典型的には近位脛骨または遠位大腿骨への従来の骨内注射に代わるものを開発することでした12。私たちの主な目標は、この技術の既知の制限、すなわち肺の腫瘍塞栓術を軽減することでした。これは、これらの塞栓性腫瘍細胞の生着と、肺に転移する確立された原発性骨腫瘍からの完全な転移カスケードを再現しない「人工性転移」をもたらします8,13。これは、確立された骨転移が離れた部位に広がる場合の状況でもあります。さらに、この技術は、同所性または血管内注射技術と比較して、骨内および均一な部位での腫瘍の生着および成長の発生率を高める骨転移のモデルを作成するためにも開発されました。このモデルには、これらの説明されている手法に比べて明確な利点があります。このモデルには、骨への腫瘍細胞の制御された一貫した送達が含まれます。また、肺塞栓術後の人工肺転移を回避し、ベースラインの均一な研究集団を確立します。このモデルでは、原発腫瘍や他の臓器への転移に起因する早期除去基準のリスクなしに、部位特異的腫瘍の利点があります。最後に、このモデルは、患者由来の異種移植片の使用を含む、変更のための大きな有用性を有する。
提示されたモデルは、外科的アプローチの後に骨に直接細胞懸濁液注入を行い、その後皮質を介して注入するか、皮質に小さな欠陥を作った後に骨髄腔に送達するのと類似しています(髄腔のリーマ化の有無にかかわらず)8,14,15,16,17 .ただし、腫瘍同種移植片の移植により、この手法は明らかに異なります。したがって、このレポートの目的は、前述のモデルの多くの制限を克服する原発性骨腫瘍と固形腫瘍からの骨転移のこのモデルを実証することでした。細胞培養、マウスモデル、マウス麻酔と手術、マウス解剖学の経験を持つ研究グループは、マウスの原発性骨腫瘍または骨転移をモデル化する技術を再現するための設備が整っています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#15 scalpel blade</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>75614</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10578911</td>
			<td>Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrams osteosarcoma cell line</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal weighing scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c nude mouse (nu/nu)</td>
			<td>Charles River Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>6-8 weeks of age. Male or female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone cement</td>
			<td>Depuy Synthes</td>
			<td>160504</td>
			<td>Optional use instead of bone wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W31G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Animalcare Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide euthanasia station</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Should be provided within animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator set at 37 &#176;C and 5% carbon dioxide</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Various</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>411412</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials (2 ml)</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin (Firefly), potassium salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>500-181-30</td>
			<td>Can be manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microradiography cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics, LLC</td>
			<td>MX-20</td>
			<td>Optional to evaluate bone response to tumor growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1371171000</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2483</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11200-33</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (&#8211; 80 &#176;C)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-794C</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11704939</td>
			<td>Can also use automated cell counter, if available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles (27 gauge)</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>DIS55510</td>
			<td>May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>1182098</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher scientifc</td>
			<td>25030081</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>British Oxygen Corporation</td>
			<td>NA</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen dewar, 5 litres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TY509X1</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#174; Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Optional. Also available in 10 ml size (354230)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002549</td>
			<td>Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing containiner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10110051</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td>Can alternatively use an electric clipper with fine blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #7 Short</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>10007-12</td>
			<td>User preference as long as it accepts #15 scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heated pad</td>
			<td>VetTech</td>
			<td>HE006</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>GT Vision Ltd.</td>
			<td>H600BV1</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive (sterile)</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td>84-1469SB</td>
			<td>Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5250061</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Use 0.05%-0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>Slip tip preferred over Luer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vented tissue culture flasks, T-75</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CLS3290</td>
			<td>Can also use smaller or larger flasks, as needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone

原発性骨腫瘍または固形腫瘍からの骨転移は、痛みを伴う骨溶解性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性病変をもたらします。これらの病変は骨構造を損ない、病的骨折のリスクを高め、患者に限られた治療選択肢を残します。原発性骨腫瘍は遠隔臓器に転移し、一部のタイプは他の骨格部位に広がる可能性があります。しかし、最近の証拠は、多くの固形腫瘍では、骨に転移した癌細胞が、最終的に他の臓器系に転移する細胞の主要な供給源である可能性があることを示唆しています。原発性骨腫瘍のほとんどの同系または異種移植マウスモデルは、腫瘍細胞懸濁液の骨内(同所性)注射を伴う。固形腫瘍からの骨格転移の一部の動物モデルも直接骨注入に依存していますが、他のモデルでは、細胞を血管内または原発腫瘍の臓器に注入することにより、骨転移カスケードの追加ステップを再現しようとします。しかし、これらのモデルはいずれも、確実に、または100%の発生率で骨転移を発症しません。さらに、腫瘍細胞の直接骨内注射は、肺の潜在的な腫瘍塞栓術と関連していることが示されている。これらの塞栓性腫瘍細胞は生着しますが、転移性カスケードを再現しません。今回われわれは,新鮮または凍結保存された腫瘍片(腫瘍細胞と間質からなる)を低侵襲手術を用いて近位脛骨に直接移植した骨肉腫のマウスモデルについて報告した。これらの動物は、再現可能な生着、成長、そして時間の経過とともに、骨溶解および肺転移を発症した。この技術は、固形腫瘍の骨転移をモデル化するために使用できる汎用性を備えており、光学的または高度なイメージングによって追跡できる1つまたは複数の細胞型、遺伝子組み換え細胞、患者由来の異種移植片、および/または標識細胞からなる移植片を容易に使用できます。本稿では,骨への固形腫瘍移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,この手法を実証する.

肯定的な結果は、腫瘍の生着と時間の経過に伴う進行性の腫瘍の成長に関連しています。腫瘍の種類によっては、骨内腫瘍の成長が進行性後肢の跛行と関連している可能性がありますが、多くの腫瘍は付随する骨疾患の兆候にもかかわらず跛行を引き起こしません。生着の成功は高度なイメージングで文書化され、目的の細胞株の骨表現型(溶骨性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone at JoVE.com

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

骨転移モデルは、一様に転移を発症したり、発生率が100%であったりすることはありません。骨内腫瘍細胞を直接注射すると、肺の塞栓術を引き起こす可能性があります。固形腫瘍移植による骨への移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,再現性のある生着と成長に導く技術を紹介します。

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

modeling-primary-bone-tumors-bone-metastasis-with-solid-tumor-graft

Research

JoVE Journal

Cancer Research

2.6K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. 骨転移モデルは、一様に転移を発症したり、発生率が100%であったりすることはありません。骨内腫瘍細胞を直接注射すると、肺の塞栓術を引き起こす可能性があります。固形腫瘍移植による骨への移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,再現性のある生着と成長に導く技術を紹介します。

ビデオ: Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

顕微鏡骨転移の効率的かつ選択的モデリングのためのイントラ腸骨動脈注入

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

がん研究

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are available for studying the significant crosstalk; however, a two-dimensional transwell system for coculture remains a classic, reliable, and easy way for this crosstalk study. Here, we present a detailed protocol that shows the coculture of bone marrow adipocytes and melanoma cells. Nevertheless, such a coculture system could not only contribute to the study of cell signal transductions of cancer cells induced by bone marrow adipocytes, but also to the future mechanistic study of bone metastasis which may reveal new therapeutic targets for bone metastasis.

Here, we present a reliable and straightforward two-dimensional (2D) coculture system for studying the interaction between tumor cells and bone marrow adipocytes, which reveals a dual effect of melanoma cell-derived factors on the bone marrow adipocytes differentiation and also poses a classic method for the mechanistic study of bone metastasis.

デュアル骨髄脂肪細胞分化に及ぼす悪性黒色腫細胞由来因子

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular interactions that exist within this microenvironment. Yet the BM microenvironment cannot be easily replicated in vitro, which potentially limits the physiologic relevance of many in vitro and ex vivo experimental models. These issues can be overcome by utilizing a xenograft model in which luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cells will specifically engraft in the mouse skeleton. When these mice are given the appropriate substrate, D-luciferin, the effects of therapy on tumor growth and survival can be analyzed by measuring changes in the bioluminescent images (BLI) produced by the tumors in vivo. This BLI data combined with positronic-emission tomography/computational tomography (PET/CT) analysis using the metabolic marker 2-deoxy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) is used to monitor changes in tumor metabolism over time. These imaging platforms allow for multiple noninvasive measurements within the tumor/BM microenvironment.

Here we use bioluminescent, X-ray, and positron-emission tomography/computed tomography imaging to study how inhibiting mTOR activity impacts bone marrow-engrafted myeloma tumors in a xenograft model. This allows for physiologically relevant, non-invasive, and multimodal analyses of the anti-myeloma effect of therapies targeting bone marrow-engrafted myeloma tumors in vivo.

NOG マウスの多発性骨髄腫, 骨髄異種のマルチ モーダルな発光とポジトロニック放出断層レントゲン写真撮影/計算断層イメージング

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

カルバリア共培養と組織病量を用いた骨リモデリングと腫瘍-骨微小環境の再現

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Machine Learning Algorithms for Early Detection of Bone Metastases in an Experimental Rat Model

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy exceeding its constituents. This protocol describes the development of an ML algorithm to predict the growth of breast cancer bone macrometastases in a rat model before any abnormalities are observable with standard imaging methods. Such an algorithm can facilitate the detection of early metastatic disease (i.e., micrometastasis) that is regularly missed during staging examinations.
The applied metastasis model is site-specific, meaning that the rats develop metastases exclusively in their right hind leg. The model&#8217;s tumor-take rate is 60%&#8211;80%, with macrometastases becoming visible in magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a subset of animals 30 days after induction, whereas a second subset of animals exhibit no tumor growth.
Starting from image examinations acquired at an earlier time point, this protocol describes the extraction of features that indicate tissue vascularization detected by MRI, glucose metabolism by PET/CT, and the subsequent determination of the most relevant features for the prediction of macrometastatic disease. These features are then fed into a model-averaged neural network (avNNet) to classify the animals into one of two groups: one that will develop metastases and the other that will not develop any tumors. The protocol also describes the calculation of standard diagnostic parameters, such as overall accuracy, sensitivity, specificity, negative/positive predictive values, likelihood ratios, and the development of a receiver operating characteristic. An advantage of the proposed protocol is its flexibility, as it can be easily adapted to train a plethora of different ML algorithms with adjustable combinations of an unlimited number of features. Moreover, it can be used to analyze different problems in oncology, infection, and inflammation.

This protocol was designed to train a machine learning algorithm to use a combination of imaging parameters derived from magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a rat model of breast cancer bone metastases to detect early metastatic disease and predict subsequent progression to macrometastases.

実験ラットモデルにおける骨転移の早期発見のための機械学習アルゴリズム

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is essential to understand the process and related mechanisms of prostate cancer bone metastasis for developing new therapeutics. For this, an animal model of bone metastasis is an essential tool. Here, we report detailed procedures to generate a bone metastasis mouse model via intra-cardiac injection of prostate cancer cells. A bioluminescence imaging system can determine whether prostate cancer cells have been accurately injected into the heart and monitor cancer cell metastasis since it has great advantages in monitoring metastatic lesion development. This model replicates the natural development of disseminated cancer cells to form micro-metastases in the bone and imitates the pathological process of prostate cancer bone metastasis. It provides an effective tool for further exploration of the molecular mechanisms and the in vivo therapeutic effects of this disease.

Here, we present a protocol for the intra-cardiac injection of human prostate cancer cells to generate a mouse model with bone metastasis lesions.

骨転移異種移植マウスモデルを作成するためのヒト前立腺癌細胞の心臓内注射

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...

骨髄性腫瘍における骨髄微小環境の単離と特性評価

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

著者スポットライト:マウス血液悪性腫瘍における骨髄微小環境の分析 

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...