저자는 이 기술의 개발에 대한 Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP의 중요한 공헌을 인정합니다.

설명된 모든 동물 실험은 영국 케임브리지에 있는 케임브리지 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 세포주의 제조
<ol><li>전통적인 세포 배양 또는 생쥐 주입을 위한 실험실의 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 세포주를 성장시킵니다. 여기에 사용된 표준 프로토콜은 10% 소 태아 혈청(FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(이하 완전 성장 배지로 알려짐)을 포함하는 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지에서의 성장입니다. 참고: 이 실험에서 Abrams 골육종 세포는 Balb/c Foxn1 nu/nu 마우스에 사용됩니다. 유방암 연구의 경우 Balb/c 마우스의 4T1 세포와 C57BL/6 마우스의 EO771 세포가 사용됩니다.</li>
	<li>5%CO2 중 37°C에서 통기된 조직 배양 플라스크 또는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 세포를 성장시킵니다.</li>
	<li>관심있는 세포주를 계대배양하고, 세포가 마우스에 이들 세포를 주입하는 데 통상적으로 사용되는 컨밀도에 도달할 때 주입을 위해 세포를 준비한다.</li>
</ol>2. 동물
<ol><li>피하 종양 발생을 위해 최소 6-8주령의 Balb/c Foxn1 nu/nu 마우스를 사용하여 동물이 급속한 성장 단계를 넘어 성체 및 골격 성숙을 달성했는지 확인합니다.</li>
	<li>수컷 또는 암컷 마우스를 사용하십시오. 호르몬 반응성 세포주(예: 암컷 생쥐의 유방암 세포 및 수컷 생쥐의 전립선암 세포)를 선택할 때 예외를 만듭니다.</li>
	<li>이종이식 실험의 경우, 정상적인 조건에서 온전한 마우스 면역 체계와 호환되지 않는 세포주를 기반으로 하는 면역결핍 무흉선 누드 마우스를 사용합니다.</li>
	<li>쥐 세포주를 이용한 동종이식 실험의 경우, 이는 또한 이질적인 마우스 유전적 및 면역적 배경을 기반으로 하는 것이 좋습니다. 그러나 syngeneic 실험의 경우 관심 있는 세포주와 동일한 균주의 동물을 사용합니다.</li>
	<li>기관의 축산 정책에 따라 표준 밀도의 가축을 사육합니다.</li>
</ol>3. 피하 종양
<ol><li>트립신 처리에 의해 배양물로부터 세포주를 수확하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.</li>
	<li>세포 생존율을 평가하고 트립판 블루 배제 방법으로 세포 밀도를 결정합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오. 90%의 최소 세포 생존율은 피하 종양을 생성하기 위해 마우스에 주사하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>1-2 x 105 세포를 0.1 내지 0.15 mL (100 내지 150 μL)의 최종 부피로 멸균된 PBS에 주입하여 세포 밀도를 조정한다. 주사 할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>대안적으로, 펠렛 세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고, 펠렛화된 세포를 희석되지 않은 멸균 기저막 매트릭스 배지에 재현탁하여 0.1 내지 0.15 mL (100 내지 150 μL)의 최종 부피로 1-2 x 105 세포를 수득한다. 더 사용할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>산소 마취에서 이소플루란으로 피하 종양 성장에 사용할 마우스를 마취합니다. 5L/min 산소에 2% 이소플루란의 유도 용량을 사용하고 2L/min 산소에 3-2% 이소플루란의 유지 용량을 사용하십시오. 계속 진행하기 전에 깜박임이나 페달 반사가 없는지 확인하십시오. 참고: 이소플루란은 흡입 마취제입니다. 적절한 청소 및 무료 가스 수집 시스템이 있는 환기가 잘 되는 장소에서 이소플루란을 사용하십시오. 기관 수의사와 상의하여 마취 유도, 유지 관리 및 모니터링 계획을 개발하고 실험실 직원이 마취 모니터링 및 흡입 마취제 취급에 대한 적절한 교육을 받았는지 확인하십시오.</li>
	<li>탈모 용액 또는 전기 클리퍼로 마취 된 생쥐의 흉부 또는 복부의 등쪽 부위에서 머리카락을 제거하십시오. 피부에 대한 잠재적인 외상을 최소화하기 위해 제모 용액이 선호됩니다. 무흉선 누드 마우스를 사용하는 경우 이 단계를 건너뜁니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 주입하기 전에 70% 에탄올 면봉으로 준비된 부위를 세척합니다.</li>
	<li>27G 바늘이 있는 1mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 견갑골의 움직임에 영향을 받지 않도록 흉부 또는 복부의 등쪽 부위에 세포를 피하 주사합니다. 대안적으로, 시판되는 세포외 기질에 현탁액으로서 세포를 피하 주사한다. 참고: 상업적으로 이용 가능한 세포외 기질에 주입하면 이러한 기질이 실온에서 응고되기 때문에 피하 공간에서 세포 현탁액의 이동이 제한됩니다.</li>
	<li>보행이 가능할 때까지 개별 케이지의 가열 패드에서 마우스를 회수하십시오. 그런 다음 마우스를 깨끗하고 건조한 침구로 일반 케이지에 넣을 수 있습니다.</li>
	<li>캘리퍼스로 등쪽 흉부 또는 복부 위에 있는 피하 종양의 크기를 모니터링하고 매주 체중을 측정하여 피하 종양이 궤양을 일으키지 않거나 마우스가 기관의 동물 관리 및 사용 위원회에서 설정한 조기 제거 기준을 충족하는지 확인합니다. 피부 궤양이나 중심 종양 괴사의 위험을 줄이기 위해 모든 치수에서 최대 15mm의 종양 크기를 권장합니다. 참고: 현지 지침을 참조하여 최대 허용 종양 크기/부피를 결정하십시오.</li>
	<li>3 내지 4주 후에 피하 종양을 갖는 마우스를CO2 흡입에 의한 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사시킨다. 마우스 안락사에 대한 기관의 허용 가능한 정책을 따르십시오.</li>
	<li>무균 수술 기술을 사용하여 피하 종양을 채취합니다. 모발을 제거한 후 70 % 에탄올로 종양 위에있는 피부를 이전과 같이 소독하십시오 (해당되는 경우). #15 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 유무에 관계없이)로 종양 위에 있는 피부를 절개합니다. 멸균 수술 용 가위로 주변의 부착 된 연조직에서 종양을 날카롭게 해부하십시오.</li>
	<li>종양을 완전한 성장 배지가 들어 있는 6웰 조직 배양 플레이트에 넣고 미리 결정된 크기의 여러 개의 작은 조각(~ 0.6mm x 0.6mm x 0.6mm – 0.25mm3 에서 최대 1mm x 1mm x 1mm x 1mm – 1mm3) #15 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 포함 또는 제외).</li>
	<li>종양 단편을 경골 내 이식 시점까지 실온에서 멸균 완전 성장 배지에 유지합니다. 루시페라아제 또는 형광 리포터 유전자를 운반하는 세포주의 경우, 생체 외 생체발광 또는 형광 이미징을 사용하여 마우스에 경골내 이식하기 전에 종양 생존력을 확인합니다.</li>
	<li>냉동 보존을 위해 20% FBS 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 보충된 완전한 성장 배지에 동일한 극저온 혼합물에 여러 단편을 넣습니다. 상업용 냉동 보존 시스템을 사용하여 –80°C에서 점진적으로 동결하고 액체 질소에 장기간 보관합니다. 액체 질소 침지를 사용하여 급속 냉동하여 후속 분석을 위해 종양 단편을 보존하되 향후 이식을 위해 보존하지 마십시오. 이러한 냉동 종양 단편을 -80°C에서 장기간 보관하십시오. 참고: 스냅 동결 종양은 생체 내에서 생착 및 성장하지 않는다는 것이 이전에 보고되었습니다8.</li>
</ol>4. 피하 종양 조각의 외과 적 이식
<ol><li>외과적 이식 전에 완전한 성장 배지에서 피하 종양의 신선하거나 냉동보존된 단편을 실온으로 가져옵니다.</li>
	<li>섹션 3에 설명된 바와 같이 산소 마취에서 이소플루란을 사용하여 관심 균주의 마우스를 마취합니다. 계속하기 전에 페달 반사가 부족한지 확인하십시오. 수술 전후 진통을 제공하기 위해 0.02-0.05 mg/kg의 용량으로 피하 부프레노르핀을 투여합니다. 필요한 경우 수술 후 6-8 시간마다 반복 할 수 있습니다.</li>
	<li>오른쪽 무릎 관절과 뒷다리의 근위 경골의 털을 제모 용액으로 제거하여 피부에 대한 잠재적 외상을 최소화하십시오.</li>
	<li>수술 용 방부제로 준비된 부위를 문지릅니다. 먼저 70% 에탄올 면봉으로 문지른 다음 클로르헥시딘과 식염수 스크럽을 번갈아 가며 문지릅니다.</li>
	<li>근위 경골을 무릎 관절의 원위 부위로 시각화하고 관절을 구부리고 확장합니다.</li>
	<li>#3 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 유무에 관계없이)를 사용하여 사지 내측의 근위 경골 수준에서 4-15mm 절개를 만듭니다. 근위 경골의 내측 피질을 노출시키기 위해 피부와 피하 조직을 절개합니다.</li>
	<li>25G 바늘 끝으로 부드러운 압력을 가하고 끝을 회전시켜 근위 경골의 내측 피질에 작은 구멍을 만듭니다. 이 구멍을 두개골과 꼬리 경골 피질 사이의 등거리 지점에서 무릎 관절 원위까지 약 2mm 만듭니다. 종양 조각의 크기에 따라 바늘 크기를 선택하십시오.</li>
	<li>멸균 집게를 사용하여 종양 조각을 집어 근위 경골의 수질강에 삽입하십시오. 27-30G 바늘을 사용하여 종양 조각을 수질관으로 조작합니다. 종양 조각의 크기에 따라 각 경골에 최소 0.5mm3 의 총 종양 부피를 이식합니다. 이것은 생성 된 종양 조각의 크기에 따라 1 개 이상의 종양 조각의 이식이 필요할 수 있습니다. 참고: 뼈 외부에서 이식편의 변위를 방지하거나 제한하기 위한 수정은 뼈 결손에 뼈 왁스 또는 뼈 시멘트를 배치하거나 뼈의 구멍 위에 젤 폼 또는 피하 지방 이식편을 배치하는 것입니다.</li>
	<li>멸균 액체 조직 접착제 또는 단일 피부 봉합사로 피부 가장자리를 바르십시오. 이 부위에 상처 클립을 사용하지 마십시오. 수술 후 형광 이미징을 사용하는 경우 조직 접착제와 봉합사 모두 형광을 발할 가능성이 있으므로 주의하십시오.</li>
	<li>보행이 가능할 때까지 개별 케이지의 가열 패드에서 마우스를 회수하십시오.</li>
</ol>5. 시리얼 및 엔드포인트 평가
<ol><li>이전에 설명한 바와 같이 산소 마취에서 isoflurane을 사용하여 마우스를 마취시킵니다.</li>
	<li>매주 디지털 방사선 촬영, 생물발광 또는 형광 이미징(루시페라아제 또는 형광 리포터 유전자를 발현하는 세포를 사용하는 경우)을 통해 비침습적으로 경골 종양 성장을 평가합니다. 이식 부위의 사지의 캘리퍼스 측정은 깨어있는 마우스에서도 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>종양이 있는 마우스(체중, 활동 수준, 호흡수, 몸단장, 자세, 정신 및 행동)에 대한 전통적인 모니터링 외에도 뒷다리 파행, 부기 및 수술 부위 감염의 징후에 대해 매주 마우스를 모니터링합니다.</li>
	<li>피부 상처가 치유될 때까지 처음 10-14일 동안 피부 수술 상처에 과도한 발적, 부기, 배액 및 상처 열개에 대해 모니터링합니다. 4-5주 후, 연구 결과 평가에 따라 마우스를 살아 있거나 안락사 후에 평가합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Mouse:+the+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research.">The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li><li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases.">Use of rodents as models of human diseases.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Wolfe, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zoledronic+acid+and+amputation+on+bone+invasion+and+lung+metastasis+of+canine+osteosarcoma+in+nude+mice.">Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinicopathological+features+and+survival+outcomes+of+patients+with+different+metastatic+sites+in+stage+IV+breast+cancer.">The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).</li><li>James, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=metastases+from+breast+carcinoma:+histopathological+-+radiological+correlations+and+prognostic+features.">metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features.</a> British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Chaffee, B. K., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+mouse+model+of+canine+osteosarcoma+with+spontaneous+metastasis.">A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis.</a> In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).</li><li>Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+volume+and+lung+metastasis+in+patients+with+osteosarcoma.">Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma.</a> Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+and+clinicopathological+features+of+osteosarcoma+metastasis+to+the+lung:+A+population-based+study.">Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study.</a> Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).</li><li>Li, W., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+primary+osteosarcoma+and+lung+metastases.">Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases.</a> Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).</li><li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+bone+metastasis.">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).</li><li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+Injection+Causes+Direct+Pulmonary+Seeding+of+Osteosarcoma+Cells+and+Is+Not+a+Spontaneous+Model+of+Metastasis:+A+Mouse+Osteosarcoma+Model.">Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model.</a> Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li><li>Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studying+prostate+cancer+bone+metastasis.">Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis.</a> BoneKey Reports. 5, 777 (2016).</li><li>Marques da Costa, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+in+vivo+orthotopic+bioluminescent+xenograft+models+from+human+osteosarcoma+cell+lines+in+Swiss+nude+and+NSG+mice.">Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice.</a> Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).</li><li>Raheem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+patient-derived+intra-femoral+xenograft+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer+that+recapitulates+mixed+osteolytic+and+osteoblastic+lesions.">A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).</li><li>Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+intrafemoral+injection+with+minimized+leakage+as+an+orthotopic+mouse+model+of+osteosarcoma.">An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma.</a> Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-iliac+Artery+Injection+for+Efficient+and+Selective+Modeling+of+Microscopic+Bone+Metastasis.">Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).</li><li>Kuchimaru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+murine+model+of+bone+metastasis+by+injecting+cancer+cells+through+caudal+arteries.">A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries.</a> Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).</li><li>Haley, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Bone+Metastases+in+Skeletally+Immature+Mice.">Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice.</a> Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).</li><li>Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompromised+and+immunocompetent+mouse+models+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).</li><li>Lefley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+clinically+relevant+in+vivo+metastasis+models+using+human+bone+discs+and+breast+cancer+patient-derived+xenografts.">Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts.</a> Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li></ol>

Hildreth 박사는 수상 번호 K01OD026527로 NIH의 자금 지원을 받았습니다.  내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

이 보고서는 종양 동종이식편의 경골내 이식 후 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 생성하기 위한 우리의 모델을 문서화합니다. 우리는 이 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있다고 믿습니다. 종양 세포 현탁액의 피하 주사와 결과 종양 조각의 경골 내 배치 모두에 대해 안전한 마취 평면이 설정되어야합니다. 피하 동종 이식편 제거와 동종 이식편의 경골 내 배치를 위해 수술 부위를 멸균 준비해야합?...

인간 및 동물 질병의 마우스 모델은 생물 의학 연구에서 점점 인기를 얻고 있습니다. 이러한 맥락에서 마우스를 사용하는 것의 유용성은 해부학과 생리학이 인간과 매우 유사하다는 것입니다. 이들은 출생 후 성숙기에 이르는 임신 기간과 기간이 상대적으로 짧으며, 개발 또는 구매 비용의 증가가 유전자 변형, 면역결핍 및/또는 인간화의 정도를 증가시키기는 하지만, 상대적으로 저렴한 비용과 주거 용이성과 크게 연관되어 있다1. 근친 교배 균주의 사용은 연구 포함 전에 대체로 균일한 동물 개체군을 초래합니다. 그들의 게놈에 대한 완전한 지식은 인간과 높은 수준의 유사성을 시사합니다. 많은 질병 과정에 대한 상동 분자 표적이 마우스 게놈에서 확인되었으며 현재 쉽게 얻을 수 있는 광범위한 마우스 특이적 시약 라이브러리가 있습니다. 따라서 더 큰 동물 모델과 비교할 때 더 빠르고 저렴한 방식으로 상대적으로 높은 처리량의 분석을 할 수 있는 기회를 제공합니다1. 또한, 특정 유전자를 전 세계적으로 또는 세포 유형 특이적 방식으로 및/또는 구성적으로 또는 유도 가능한 방식으로 과발현 또는 결실시킬 수 있는 유전자 편집 전략의 출현과 함께, 이는 인간 및 동물 질병 조사에 매우 생물학적으로 유용한 모델 시스템을 대표한다2.
암은 마우스 모델이 큰 유용성을 갖는 분야 중 하나입니다. 암의 유전자 마우스 모델은 세포가 발암성 형질전환을 겪기 위해 종양유전자 또는 종양 억제 유전자의 발현 조절에 단독으로 또는 조합하여 의존합니다. 마우스에 원발성 또는 확립 된 종양 세포주를 주입하는 것도 수행됩니다. 인간 또는 생쥐를 포함한 다른 동물 종의 세포주 또는 조직의 도입은 생체 내에서 가장 널리 사용되는 암 모델로 남아 있습니다. 면역이 저하된 마우스에서 이종 종(이종 이식편)의 세포 및 조직을 사용하는 것이 가장 일반적으로 시행된다2. 그러나, 숙주와 수용자가 모두 동일한 종인 동종이식 종양 세포 또는 조직의 사용은 동종 시스템에서 동일한 숙주 마우스 균주와 결합될 때 온전한 면역계와의 상호작용을 허용한다3.
원발성 골 종양 또는 고형 종양으로 인한 골 전이는 고통스러운 골용해성, 조골용해성 병변, 또는 혼합성 골용해성/조골아세포 병변을 초래한다 3,4. 이 종양은 뼈 구조를 손상시켜 병적 골절의 위험을 증가시키고 환자에게 제한된 치료 옵션을 남깁니다. 원발성 뼈 종양은 먼 장기로 전이되며 일부 유형은 다른 골격 부위로 퍼질 수 있습니다. 유방암 환자에서 뼈는 첫 번째 전이의 가장 흔한 부위이며 전이성 질환의 가장 빈번한 첫 번째 부위입니다 5,6. 또한, 파종성 종양세포(disseminated tumor cell, DTCs)는 다른 장기의 전이를 진단하기 전에 골수에 존재하며, 전이의 진행을 예측한다7. 따라서 뼈에 존재하는 암세포는 궁극적으로 다른 장기 시스템으로 전이되는 세포의 원천이라고 믿어집니다. 고형 종양 전이가 주로 폐와 림프절에서 전이가 발생하는 많은 마우스 모델이 존재하며, 종양 유형 및 주사 기술에 따라 잠재적으로 다른 장기 시스템이 발생할 수 있다3. 그러나, 뼈 전이의 마우스 모델은 마우스가 원발성 종양 부담 또는 다른 장기로의 전이로부터 조기 제거 기준에 도달하기 전에 신뢰할 수 있고 재현성 있게 부위 특이적 골격 전이를 생성하고 뼈 전이를 진행하는 것이 부족하다. 우리는 생쥐의 근위 경골에 고형 종양 동종이식편을 외과적으로 이식하는 원발성 골종양 골육종의 모델을 보고했다8. 뼈 종양은 생쥐의 100 %에서 형성되었고 88 %는 폐 전이를 일으켰습니다. 이 전이 발생률은 사람(~20-50%)에서 임상적으로 일반적으로 보고되는 것보다 높지만 폐가 골육종의 가장 흔한 전이 부위이기 때문에 큰 관심을 끌고 있습니다 9,10,11. 이 모델은 원발성 골 종양을 모델링하는 데 유리하지만 유방, 폐, 전립선, 갑상선, 간, 신장 및 위장관 종양과 같은 다른 골성 고형 종양의 뼈 전이를 모델링하는 데에도 큰 유용성을 가지고 있습니다.
이 모델 개발의 근거는 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 모델링하기 위해 일반적으로 근위 경골 또는 원위 대퇴골에 전통적인 골내 주사에 대한 대안을 개발하는 것이었다12. 우리의 주요 목표는 이 기술의 알려진 한계, 즉 폐의 종양 색전술을 완화하는 것이었습니다. 그 결과 이러한 색전성 종양 세포의 생착과 폐로 전이되는 확립된 원발성 골 종양으로부터 완전한 전이성 캐스케이드를 요약하지 않는 "인공성 전이"가 발생합니다 8,13. 이것은 또한 확립 된 뼈 전이가 먼 부위로 퍼지는 상황 일 것입니다. 또한, 이 기술은 동소 또는 혈관 내 주사 기술과 비교할 때 뼈와 균일한 부위에서 종양의 생착 및 성장의 더 큰 발생률을 보장하는 뼈 전이 모델을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 모델은 이러한 설명된 기술에 비해 뚜렷한 이점이 있습니다. 이 모델은 종양 세포를 뼈 내로 제어되고 일관되게 전달하는 것을 포함합니다. 또한 폐색전술 후 인공성 폐 전이를 방지하고 기준선 균일 연구 모집단을 설정합니다. 원발성 종양 또는 다른 장기로의 전이로 인한 조기 제거 기준의 위험 없이 이 모델을 사용하면 부위 특이적 종양의 이점이 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 환자 유래 이종이식의 사용을 포함하여 수정에 큰 유용성을 가지고 있습니다.
제시된 모델은 외과적 접근 방식에 따라 뼈에 직접 세포 현탁액을 주입한 후 피질을 통해 주사하거나 피질에 작은 결함을 만든 후(수질을 빼내거나 빼지 않고) 골수강으로 전달하는 것과 유사합니다.8,14,15,16,17 . 그러나 종양 동종 이식편을 이식하면이 기술이 뚜렷하게 다릅니다. 따라서 이 보고서의 목적은 이전에 설명된 모델의 많은 한계를 극복하는 원발성 뼈 종양 및 고형 종양으로부터의 뼈 전이의 이 모델을 입증하는 것이었습니다. 세포 배양, 마우스 모델, 마우스 마취 및 수술, 마우스 해부학 경험이 있는 연구 그룹은 마우스의 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 모델링하는 기술을 재현할 수 있는 장비를 잘 갖추고 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#15 scalpel blade</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>75614</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10578911</td>
			<td>Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrams osteosarcoma cell line</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal weighing scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c nude mouse (nu/nu)</td>
			<td>Charles River Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>6-8 weeks of age. Male or female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone cement</td>
			<td>Depuy Synthes</td>
			<td>160504</td>
			<td>Optional use instead of bone wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W31G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Animalcare Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide euthanasia station</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Should be provided within animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator set at 37 &#176;C and 5% carbon dioxide</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Various</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>411412</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials (2 ml)</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin (Firefly), potassium salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>500-181-30</td>
			<td>Can be manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microradiography cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics, LLC</td>
			<td>MX-20</td>
			<td>Optional to evaluate bone response to tumor growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1371171000</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2483</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11200-33</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (&#8211; 80 &#176;C)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-794C</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11704939</td>
			<td>Can also use automated cell counter, if available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles (27 gauge)</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>DIS55510</td>
			<td>May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>1182098</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher scientifc</td>
			<td>25030081</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>British Oxygen Corporation</td>
			<td>NA</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen dewar, 5 litres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TY509X1</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#174; Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Optional. Also available in 10 ml size (354230)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002549</td>
			<td>Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing containiner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10110051</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td>Can alternatively use an electric clipper with fine blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #7 Short</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>10007-12</td>
			<td>User preference as long as it accepts #15 scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heated pad</td>
			<td>VetTech</td>
			<td>HE006</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>GT Vision Ltd.</td>
			<td>H600BV1</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive (sterile)</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td>84-1469SB</td>
			<td>Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5250061</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Use 0.05%-0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>Slip tip preferred over Luer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vented tissue culture flasks, T-75</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CLS3290</td>
			<td>Can also use smaller or larger flasks, as needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone

원발성 뼈 종양 또는 고형 종양의 뼈 전이는 고통스러운 골용해성, 조골세포 또는 혼합성 골용해성/조골아세포 병변을 초래합니다. 이러한 병변은 뼈 구조를 손상시키고 병적 골절의 위험을 증가시키며 환자에게 제한된 치료 옵션을 남깁니다. 원발성 뼈 종양은 먼 장기로 전이되며 일부 유형은 다른 골격 부위로 퍼질 수 있습니다. 그러나 최근의 증거에 따르면 많은 고형 종양에서 뼈로 퍼진 암세포가 궁극적으로 다른 장기 시스템으로 전이되는 세포의 주요 공급원이 될 수 있습니다. 원발성 골 종양의 대부분의 동계 또는 이종이식 마우스 모델은 종양 세포 현탁액의 골내(orthotopic) 주사를 수반합니다. 고형 종양에서 골격 전이의 일부 동물 모델은 직접 뼈 주입에 의존하는 반면, 다른 모델은 세포를 혈관 내 또는 원발성 종양의 기관에 주입하여 뼈 전이성 캐스케이드의 추가 단계를 요약하려고 시도합니다. 그러나 이러한 모델 중 어느 것도 안정적으로 또는 100%의 발생률로 뼈 전이를 진행하지 않습니다. 또한, 종양 세포의 직접적인 골내 주사는 폐의 잠재적인 종양 색전술과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 색전성 종양 세포는 생착되지만 전이성 캐스케이드를 재현하지는 않습니다. 우리는 최소 침습 수술 기술을 사용하여 신선하거나 냉동 보존된 종양 조각(종양 세포와 기질로 구성됨)을 근위 경골에 직접 이식하는 골육종의 마우스 모델을 보고했습니다. 이 동물들은 재현 가능한 생착, 성장, 그리고 시간이 지남에 따라 골용해 및 폐 전이를 일으켰습니다. 이 기술은 고형 종양 뼈 전이를 모델링하는 데 사용할 수 있는 다재다능함을 가지고 있으며 하나 또는 여러 세포 유형, 유전자 변형 세포, 환자 유래 이종 이식편 및/또는 광학 또는 고급 이미징으로 추적할 수 있는 표지된 세포로 구성된 이식편을 쉽게 사용할 수 있습니다. 여기에서는 뼈에 고형 종양 이식 이식을 사용하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하는 이 기술을 시연합니다.

양성 결과는 시간 경과에 따른 종양 생착 및 진행성 종양 성장과 관련이 있습니다. 종양 유형에 따라 골내 종양 성장은 진행성 뒷다리 파행과 관련이 있을 수 있지만 많은 종양은 수반되는 뼈 질환의 징후에도 불구하고 파행을 유발하지 않습니다. 성공적인 생착은 고급 영상으로 문서화되었으며, 이에 따라 관심 세포주의 뼈 표현형(골용해성, 조골세포 또는 혼합 골용해성/조골아세포 전이)과 관?...

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Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

modeling-primary-bone-tumors-bone-metastasis-with-solid-tumor-graft

Research

JoVE Journal

Cancer Research

2.6K 조회수.  University of Alabama at Birmingham. 뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

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Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

연구

암 연구학

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are available for studying the significant crosstalk; however, a two-dimensional transwell system for coculture remains a classic, reliable, and easy way for this crosstalk study. Here, we present a detailed protocol that shows the coculture of bone marrow adipocytes and melanoma cells. Nevertheless, such a coculture system could not only contribute to the study of cell signal transductions of cancer cells induced by bone marrow adipocytes, but also to the future mechanistic study of bone metastasis which may reveal new therapeutic targets for bone metastasis.

Here, we present a reliable and straightforward two-dimensional (2D) coculture system for studying the interaction between tumor cells and bone marrow adipocytes, which reveals a dual effect of melanoma cell-derived factors on the bone marrow adipocytes differentiation and also poses a classic method for the mechanistic study of bone metastasis.

골 Adipocytes 차별화에 흑색 종 세포 유래 요인의 이중 효과

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular interactions that exist within this microenvironment. Yet the BM microenvironment cannot be easily replicated in vitro, which potentially limits the physiologic relevance of many in vitro and ex vivo experimental models. These issues can be overcome by utilizing a xenograft model in which luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cells will specifically engraft in the mouse skeleton. When these mice are given the appropriate substrate, D-luciferin, the effects of therapy on tumor growth and survival can be analyzed by measuring changes in the bioluminescent images (BLI) produced by the tumors in vivo. This BLI data combined with positronic-emission tomography/computational tomography (PET/CT) analysis using the metabolic marker 2-deoxy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) is used to monitor changes in tumor metabolism over time. These imaging platforms allow for multiple noninvasive measurements within the tumor/BM microenvironment.

Here we use bioluminescent, X-ray, and positron-emission tomography/computed tomography imaging to study how inhibiting mTOR activity impacts bone marrow-engrafted myeloma tumors in a xenograft model. This allows for physiologically relevant, non-invasive, and multimodal analyses of the anti-myeloma effect of therapies targeting bone marrow-engrafted myeloma tumors in vivo.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Machine Learning Algorithms for Early Detection of Bone Metastases in an Experimental Rat Model

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy exceeding its constituents. This protocol describes the development of an ML algorithm to predict the growth of breast cancer bone macrometastases in a rat model before any abnormalities are observable with standard imaging methods. Such an algorithm can facilitate the detection of early metastatic disease (i.e., micrometastasis) that is regularly missed during staging examinations.
The applied metastasis model is site-specific, meaning that the rats develop metastases exclusively in their right hind leg. The model&#8217;s tumor-take rate is 60%&#8211;80%, with macrometastases becoming visible in magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a subset of animals 30 days after induction, whereas a second subset of animals exhibit no tumor growth.
Starting from image examinations acquired at an earlier time point, this protocol describes the extraction of features that indicate tissue vascularization detected by MRI, glucose metabolism by PET/CT, and the subsequent determination of the most relevant features for the prediction of macrometastatic disease. These features are then fed into a model-averaged neural network (avNNet) to classify the animals into one of two groups: one that will develop metastases and the other that will not develop any tumors. The protocol also describes the calculation of standard diagnostic parameters, such as overall accuracy, sensitivity, specificity, negative/positive predictive values, likelihood ratios, and the development of a receiver operating characteristic. An advantage of the proposed protocol is its flexibility, as it can be easily adapted to train a plethora of different ML algorithms with adjustable combinations of an unlimited number of features. Moreover, it can be used to analyze different problems in oncology, infection, and inflammation.

This protocol was designed to train a machine learning algorithm to use a combination of imaging parameters derived from magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a rat model of breast cancer bone metastases to detect early metastatic disease and predict subsequent progression to macrometastases.

실험래기 모델에서 뼈 전이를 조기에 감지하기 위한 기계 학습 알고리즘

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is essential to understand the process and related mechanisms of prostate cancer bone metastasis for developing new therapeutics. For this, an animal model of bone metastasis is an essential tool. Here, we report detailed procedures to generate a bone metastasis mouse model via intra-cardiac injection of prostate cancer cells. A bioluminescence imaging system can determine whether prostate cancer cells have been accurately injected into the heart and monitor cancer cell metastasis since it has great advantages in monitoring metastatic lesion development. This model replicates the natural development of disseminated cancer cells to form micro-metastases in the bone and imitates the pathological process of prostate cancer bone metastasis. It provides an effective tool for further exploration of the molecular mechanisms and the in vivo therapeutic effects of this disease.

Here, we present a protocol for the intra-cardiac injection of human prostate cancer cells to generate a mouse model with bone metastasis lesions.

인간 전립선암 세포의 심장내 주사를 통해 뼈 전이 이종이식 마우스 모델 생성

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...

Isolation and Characterization of Bone Marrow Microenvironment in Myeloid Neoplasms

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

저자 스포트라이트: Analyzing Bone Marrow Microenvironment in Murine Hematological Malignancies(쥐 혈액 악성 종양의 골수 미세환경 분석) 

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...