هذه التقنية تسمح لنا بجمع مجموعات واسعة النطاق من الديدان لاستخدامها في منصات omics متعددة مع الحد الأدنى من التلاعب. هذه التقنية تسمح لنا بجمع مجموعات C.elegans المرحلة المختلطة عبر تجارب omics متعددة للحصول على صورة شاملة لكل عينة. للتبييض بقعة من البالغين gravid على لوحات الثقافة على نطاق واسع، لهب اختيار دودة على الموقد بونسن واستخدام اختيار لغرف E.coli الطازجة من حافة العشب البكتيري على لوحة ثقافة واسعة النطاق.
اختيار شخص بالغ واحد gravid من لوحة قطعة الرابعة للتبييض بقعة وإضافة خمسة ميكرولترات من محلول الهيبوكلوريت القلوية المعدة حديثا في زاوية واحدة من لوحة ثقافة واسعة النطاق بعيدا عن حديقة E.coli. وضع الكبار gravid في محلول الهيبوكلوريت القلوية والاستفادة من النيماتودا لتعطيل الجلد والإفراج عن البيض. عندما يتم وضع ما مجموعه خمسة بالغين بالتساوي حول حديقة الإشريكية القولونية بنفس الطريقة ، ضع الغطاء مرة أخرى على اللوحة.
لحصاد عينات من لوحات الثقافة على نطاق واسع، صب 50 ملليلتر من محلول M9 على سطح لوحة ثقافة واحدة على نطاق واسع ودوامة لوحة لضمان أن M9 يغطي كامل سطح النماتودا نمو المتوسطة agarose. رئيس ماصة المصلية العقيمة مع M9 وإمالة لوحة بحيث تجمع السكان M9 ودودة في زاوية واحدة من لوحة. استخدام ماصة تستعد لترطيب تعليق دودة وإضافة الديدان إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
ضع الأنبوب على الروك لتعطيل أي كتل بكتيرية والحطام. عندما يتم جمع جميع الديدان من جميع الصفائح الثلاث ، نقل 15 ملليلتر من الديدان من كل أنبوب إلى كل من ثلاثة أنابيب مخروطية 15 ملليلتر والرواسب الديدان في الأنابيب عن طريق الطرد المركزي. يستنشق بعناية الشعيرات الفائقة دون إزعاج الكريات دودة وإضافة 13 ملليلتر من تعليق دودة إلى كل أنبوب.
عكس الأنابيب لإعادة إنفاق الكريات وغسل أكبر قدر ممكن من البكتيريا والحطام والطرد المركزي الديدان مرة أخرى. عندما يتم جمع كل مجموعة دودة كاملة ، اغسل الكريات الدودة ثلاث مرات في 10 ملليلتر من محلول M9 الطازج لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، أعيد إنفاق كل بيليه دودة نظيفة في 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج.
لتقدير حجم السكان، تمييع بسرعة ثلاثة 100 ميكرولتر aliquots من عينة دودة من كل أنبوب في 900 ميكرولتر من محلول M9 لكل عينة واستخدام aliquots لجعل التخفيفات التسلسلية. وضع تعليق عينة دودة الأسهم على الروك للحركة المستمرة للثقافات في حين يجري عد aliquots وخلط تخفيف دودة حتى تكون متجانسة. إضافة خمسة ميكرولترات من الحل من أول عينة دودة إلى 10 إلى شريحة المجهر الزجاجي وإحصاء الديدان عن طريق المجهر الخفيف.
إذا كان هناك أقل من 50 دودة في العينة، عد تخفيفات 1:100 و 1:1، 000. إذا كان هناك أكثر من 50 دودة، انتقل إلى التخفيف التسلسلي التالي. بعد عد كل تكرار aliquot من كل تخفيف ثلاث مرات ، متوسط عدد التخفيف لتحديد حجم السكان المقدر للدودة.
ثم تقسيم عينات دودة في aliquots التجريبية المناسبة وفلاش تجميد العينات في النيتروجين السائل للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لإعداد عينة دودة لقياس الخلايا تدفق الجسيمات الكبيرة، تمييع ما يقرب من خمس مرات 10 إلى المرحلة الرابعة المختلطة دودة aliquot إلى حجم نهائي من 10 ملليلتر من محلول M9 وإضافة 200 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر E.coli و 1:50 تمييع 0.5 ميكرومولار الأحمر الفلورسنت حل ميكروفلورسنت لتعليق الدودة. بعد احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز، وجمع الديدان وmicrospheres عن طريق الطرد المركزي وغسل الديدان مرتين مع محلول M9 الطازجة لإزالة أي البكتيريا الزائدة وmicrospheres غير المغرضة.
بعد الغسيل الثاني، أعيد إنفاق بيليه في خمسة ملليلترات من محلول M9. إذا كانت بيليه تبدو نظيفة، إضافة خمسة ملليلتر من M9 تكملها مع 50 ميليمولار الصوديوم azide إلى الديدان ووضع الأنبوب على الروك لتصويب والقتل الرحيم على حد سواء الديدان لعد دقيق والتحجيم. بالنسبة لتوثيق توزيع السكان، افتح قالب اللوحة 384 جيدا والمعايرة وعين القالب لتوزيع 20 جسما مسورا في أربعة آبار للحصول على أربع نسخ متماثلة تقنية لكل منطقة مسورة لكل منطقة من مناطق البار العشرين للعينة.
قم بتحميل عينة من الديدان مقدارها 40 ملليلتر على مقياس تدفق الجسيمات الكبير والبدء في فرز العينة تلقائيا مع تحريك العينة باستمرار لمنع التسوية والاستغناء عن الكائنات في نفس الوقت من العينة في لوحة 384-well معايرة. وبمجرد فرز العينة بأكملها والاستغناء عن الحد الأقصى لعدد المناطق المسورة في لوحة 384 بئرا، قم بإزالة العينة من مقياس الخلايا وتنظيف الجهاز. تم اختبار طريقة لوحة الثقافة على نطاق واسع على 15 سلالة من C.Elegans ، بما في ذلك مزيج من المسوخ مركز علم الوراثة Caenorhabditis وسلالات Caenorhabditis elegans الطبيعية التنوع الموارد البرية.
في هذا التحليل، أسفرت طريقة لوحة الثقافة على نطاق واسع عن أحجام سكانية من حوالي 94 و500 إلى 9 و290 و000. وكان متوسط حجم السكان ضمن السلالة المرجعية PD1074 وعبر السلالات حوالي 2.4 مليون دودة. لم توجد اختلافات كبيرة في أحجام السكان المقدرة بين سلالات C.elegans على مدار ما متوسطه 12.2 يوم نمو لوحات الثقافة على نطاق واسع.
استغرق PD1074 لوحات الثقافة على نطاق واسع بين 10 إلى 14 يوما للنمو إلى مرحلة مختلطة كاملة من السكان مع متوسط وقت النمو من 12.2 يوما. ونمت أبطأ سلالة نموا لمدة أقصاها 20 يوما ونمت السلالة الأسرع نموا لمدة لا تقل عن 10 أيام. في توزيع العينة هذا ل PD1074 ، تم قياس الديدان من مرحلة L1 من خلال البالغين gravid على مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة.
وكشف التصوير والتصور اللاحقان للاختلافات في توزيع السكان عبر العينات أن خط الأنابيب ولد مجموعة مختلطة من ال C.elegans. من المهم عد الديدان بدقة في جميع أنحاء مجموعة العينات حتى تحصل على بيانات قابلة للمقارنة عبر النمو والدراسات. يمكن تطبيق نهج الجمع هذا على تسلسل الحمض النووي الريبي وعلم الجينوم وتحليلات علم الاقتصادات الأخرى لتوسيع فهمنا للديناميكيات المعقدة التي تحدث داخل مجموعات C.elegans.
تسمح لنا هذه التقنية بجمع مجموعات C.elegans المختلطة عبر تجارب omics متعددة للحصول على صورة شاملة لكل عينة.
